DCR3矿机
『壹』 求一医学标书的样本
目前，移植排斥反应仍然是制约肝移植疗效的主要原因。虽然由于免疫抑制剂的临床应用，肝移植的1年的存活率大幅度提高，已超过了80%。但是终生服用免疫抑制剂不仅成为患者沉重的经济负担，而且造成机体的免疫功能低下，可能促进肝炎及肿瘤复发，诱发感染、肿瘤等疾病。因此，找寻诱导特异性移植耐受的新方法，是克服移植排斥反应的最佳途径。
特异性移植耐受是指在无需使用免疫抑制药物的情况下，受者的免疫系统对同种异体或异种供体抗原长期不发生免疫反应，而对其它抗原可发生正常免疫应答的状态。目前认为，诱导机体产生免疫耐受涉及免疫清除、免疫失能、免疫抑制和免疫忽视四类机制[1]。根据以上诱导免疫耐受的机制，学者们发展出许多诱导移植耐受的新方法[2]：(1)在胸腺内直接注射表达供体抗原的细胞，在胸腺内通过克隆清除诱导免疫耐受。(2)利用骨髓移植造成造血细胞嵌合体诱导耐受。(3)阻断T细胞活化的共刺激信号通路。(4)输注供体树突状细胞(Dentritic cell，DC)诱导耐受。(5)针对T细胞粘附和活化相关分子的单克隆抗体：抗T细胞及T细胞亚群的单抗；抗粘附分子或细胞因子的单抗。(6)其它特异性免疫抑制的方法：合成肽阻断TCR对同种异体抗原的识别；合成肽阻断趋化因子及其受体。以上方法均不同程度地诱导了对供体抗原的耐受，但它们存在如下不足：(1)成年人胸腺已经萎缩，无法在胸腺内直接注射表达供体抗原的细胞，故该方法适用范围大大受限。(2)供体骨髓移植能诱导部分耐受，但不易控制嵌合程度，移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的发生率大大增加。(3)DC诱导的淋巴细胞失能状态可通过给予外源性IL-2而逆转；感染或其它因素引起机体强烈的免疫应答，产生大量的IL-2等细胞因子也可以通过旁效应解除失能的细胞克隆；失能状态的维持需要抗原的持续存在，抗原的去除也能逆转失能。(4)阻断协同刺激通路、应用针对T细胞粘附和活化相关分子的单克隆抗体、合成肽阻断TCR对同种异体抗原的识别、阻断趋化因子及其受体等方法能诱导出确切的免疫抑制，但是其作用范围是全身性的、非特异性的，且一旦中止阻断剂的供给，则移植耐受消失。总之， 目前诱导移植耐受的方法存在非特异性、容易逆转、实际操作困难等缺陷。
肝移植排斥反应启动时，首先表现为淋巴细胞对汇管区中央静脉周围的浸润，随着排斥反应的进展，淋巴细胞的损伤导致小叶间胆管上皮细胞、中央静脉内皮细胞的炎症，最后波及汇管区周围的肝实质细胞，造成广泛的肝脏炎性反应。因此肝移植排斥反应的过程是从汇管区启动，进而扩展至小叶间胆管上皮细胞、中央静脉内皮细胞、汇管区周围的肝实质细胞。移植排斥反应发生时，CTL细胞在活化后可以通过以下两条途径杀伤靶细胞：(1)穿孔素/颗粒酶途径。(2)Fas/FasL途径：在CTL细胞识别靶细胞后，细胞表面表达的高水平FasL与靶细胞表面的Fas相互识别，通过Fas触发靶细胞内部的凋亡程序，使靶细胞发生程序性死亡。体外实验证实两条途径相互独立。然而体内实验证实单一阻断Fas/FasL途径即可抑制CTL对靶细胞的杀伤，其原因可能与体内环境有关28.
诱骗受体3(Decoy receptor 3，DcR3)是一种新发现的可结合FasL的可溶性TNFR超家庭成员，RNA印迹表明DcR3 mRNA 表达于胎肺、脑、肝及成人脾、结肠和肺，特别是在肺癌和结肠癌细胞系的表达很高，也可由T细胞丝裂原激活的外周血单核细胞分泌。DcR3 分子质量为35kDa，肽链长300个氨基酸残基。DcR3 的配体是LIGHT、FasL、TL1A。其主要作用有：(1)与Fas竞争性结合FasL，阻断FasL所诱导的细胞凋亡，这一作用可以减弱CTL和NK细胞对靶细胞的杀伤[14]。(2)通过抑制LIGHT与HveA 或TR2之间的双向信号转导、TL1A至DcR3的单向信号转导来抑制T细胞激活。7 (3)抑制CXCL12/基质细胞来源的因子1α(SDF-1α) 、FasL对T细胞的趋化作用，从而减少CD4+和CD8+T细胞对肿瘤的浸润。25. 27．(4)通过调节DC分化和成熟从而抑制CD4+ T细胞增生。20．(5)抑制T细胞伪足形成，阻止它们形成不可分离的细胞簇从而调节T细胞与其它细胞如APC的相互作用。7
因此根据其作用机理，人们推测其可能有以下四方面的作用(1)肿瘤细胞逃避免疫监视。（2）抗炎作用。(3)致癌作用。（4）诱导移植耐受。目前的研究工作已经肯定DcR3基因对肿瘤细胞逃避免疫监视、抑制炎症反应的作用，但DcR3基因的高表达与细胞癌变无相关性，不是癌基因。Wu等证实DcR3减少了FasL、IFN-γ诱导的胰岛细胞凋亡及胰岛素释放，可防止同种异基因胰岛移植时的胰岛原发性无功能。2Zhang等于心脏移植术前一天开始连续7天静脉注射DcR3，小鼠心脏存活时间比对照组延长3.3天，提示DcR3可以减弱T细胞对同种异体抗原的反应。24我们利用腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)（AAV Helper－Free System, Stratagene 公司）作为DcR3基因的载体，将AAV病毒颗粒从门静脉、肝动脉、胆管注入冷保存时的供肝，成功实现了DcR3基因在供肝的表达，在没有使用免疫抑制剂的情况下，供肝正常存活了105天（目前仍然存活，继续观察中），而对照组仅存活了15天（见研究工作基础）。AAV Helper－Free System的特点有：病毒载体产生、效价滴定阶段均不需野生型腺病毒共感染，因此有极高的生物安全性、宿主的免疫反应极小；AAV可感染的细胞类型广泛，感染不依赖于活跃的细胞分裂；AAV病毒滴度高，常规可达107病毒颗粒/ml，经浓缩可达1012病毒颗粒/ml；AAV在允许复制的条件下可在染色体外复制，在不能复制的条件下可以5-10%的效率定点整合入宿主19号染色体的一个2-4kb的区域，因此AAV被证明有应用于基因长期表达的价值。我们目前的研究工作的特色有：（1）证明了腺相关病毒携带的DcR3基因可以诱导肝移植耐受。(2)采用AAV Helper－Free System克服了逆转录病毒载体转导效率低、随机整合入受者染色体中而致肿瘤的危险的缺点[1]以及腺病毒载体虽然有较高的转导率,但因不能在染色体外复制或整合入受者染色体中,目的基因只能一过性表达的缺点[2]。我们目前研究工作的缺陷有：（1）DcR3基因仅在肝脏血管内皮细胞、胆管上皮细胞表达，而急性排斥反应启动时CTL细胞首先浸润的是汇管区的中央静脉周围，因此它尚不能阻止急性排斥反应的启动，仅能阻止CTL细胞血管内皮细胞、胆管上皮细胞的攻击。（2）DcR3基因转染的血管内皮细胞、胆管上皮细胞是成熟的细胞。虽然携带DcR3基因的AAV可在染色体外复制或整合入宿主基因组而使DcR3基因存在长期表达的可能，但是成熟细胞存在新老交替，DcR3基因的表达随着细胞的死亡而消失。因此为了完善我们目前的研究工作，我们需要作以下的改进：（1）将DcR3基因的表达定位于汇管区中央静脉周围，抑制排斥反应的启动。如能进一步将DcR3基因表达于血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞，则更能防止个别活化的CTL细胞对它们的攻击，从而形成抑制排斥反应的“双保险”。（2）实现DcR3基因的持续表达。
肝干细胞（Hepatic Stem Cell，HSC）是指具有自我更新能力和具有分化形成肝细胞与胆管细胞潜能的原始细胞。最近有人证实它尚可分化为血管内皮细胞(Gao Z, McAlister VC, Williams GM. Repopulation of liver endothelium by bone-marrow-derived cells. Lancet. 2001 Mar 24;357(9260):932-3.) [11]。肝干细胞的基本特征可概括为两点：①具有多向分化能力，可向肝细胞、胆管上皮细胞、肝脏血管内皮细胞分化。②具有自我更新与自我维持能力，对肝脏损伤或疾病产生反应并进行修复。其形态特点是细胞体积小、核大而胞质少、呈卵圆形、具有特殊的表面标志如AFP、肝细胞标志（白蛋白）、胆管上皮细胞标志（CK7、CK19）以及肝细胞、胆管上皮细胞共有的标志(CK8、CK18)。目前有人证实其尚有血管内皮细胞的标志。
该类细胞不仅在胚胎肝组织中存在，而且在成年肝组织中也存在。肝内的肝干细胞称为卵圆细胞(Hepatic Oval Cell，HOC)或小肝细胞。它们在正常情况下位于肝脏汇管区的Hering小管[D]，当肝脏受到损伤（肝毒性药物、手术、创伤、缺血再灌注等）时，它们迅速增生分化，补充受损的肝细胞、胆管上皮细胞、肝脏血管内皮细胞分化，因而被称为肝干细胞池[A]。目前大量文献证实，肝脏损伤时，肝脏有三个水平的细胞修复：肝细胞、Hering 小管的双向干细胞、Hering小管周围的来自骨髓的肝干细胞。骨髓来源的干细胞可定居于Hering小管周围，在肝脏损伤时发挥修复作用[K]。Theise ND等通过三维观测得出Hering 小管、汇管区周围是肝干细胞存在的场所的结论[G]。Petersen 证实肝内存在骨髓来源的干细胞，Theise 大鼠2%，人4-40%。Alison0.5-2%(hsc8,78,79)。Lagasse 30%.认为Hering管可能是人肝干细胞起源分化及滞留场所(TheiseND,SaxenaR,PortmannBC,etal.[J].Hepa-tology,1999,30:1425-1433.)
肝干细胞的肝外来源包括胰腺的上皮细胞、胰岛前体细胞、骨髓造血干细胞[3,4]。自1999年Petersen等发现肝卵圆细胞可来源于骨髓后,从骨髓细胞中鉴定肝干细胞成为近年研究的热点。目前研究证实从骨髓中分离纯化的造血干细胞的多个亚群在一定的微环境或细胞因子的诱导下可分化为肝干细胞[B]。目前,在骨髓中已发现多种细胞亚群具有分化为肝细胞的潜能,如KTLS细胞(c-kithighThylowLin-Sca-1+)[H]、β2-m-Thy-1+细胞[12]、CD44-CD45-HLA-c-kit-的多能成体前体细胞(multipotent alt progenitor cells, MAPC)[I]及C1qRp+细胞(Lin-CD45+CD38-CD34+/-)[J]等。这些细胞均涉及多个不同的表面标志,可能代表着骨髓干细胞的不同发育阶段或谱系中的不同分支。这些细胞因子肯定存在于细胞的微环境中，包括细胞外基质中参与粘附过程的信号分子以及参与正常细胞发育、分化、成熟的细胞因子[B] [E]。Petersen 等[L]、Theise等[M,N]和Alison等[O]的研究相继指出,骨髓干细胞或造血干细胞能够在鼠肝内转化成为肝卵圆细胞甚至成熟的肝细胞和胆管细胞,并同时证明这种现象也存在于人类体内。用高浓度的肝细胞生长因子(HGF)诱导体外培养的大鼠骨髓细胞,RT-PCR检测到白蛋白及AFP的表达,免疫细胞化学也证实了经诱导的细胞出现了AFP、白蛋白及CK8/18等肝前体细胞的特征性表达。应用磁株细胞筛选法分离人或大鼠骨髓细胞中的β2m-Thy-1+细胞,能够表达肝细胞的特征[P]。这些骨髓来源的肝干细胞(BDHSC)肝内移植后很快就整合入肝板,并且分化为成熟的肝细胞,而在体外培养的过程中加入胆汁化血清可促进它们向肝细胞方向分化。蔡云峰等用免疫磁珠法成功分离出骨髓干细胞的多个亚群，并证明大鼠骨髓内β2微球蛋白阴性(β2 m- ) 细胞经体外培养诱导后呈多角形细胞表现, 白蛋白、AFP、 CK8 / 1 8表达阳性，其他干细胞类型未见类似变化。提示该亚群骨髓干细胞有向肝干细胞分化的能力。我们参照他们介绍的方法成功分离了1.5×105数量级的肝干细胞纯度为95%，培养7天后可达2×106数量级。经免疫组化染色证明其有肝细胞、胆管上皮细胞、血管内皮细胞的特异性标志，因此推测其可能分化为以上3种细胞（见研究工作基础）。这些研究结果都说明骨髓细胞中存在有能分化为肝细胞的干细胞群。
肝脏基因治疗的一大难题是被用作基因修饰的成熟肝细胞在体外不易扩增和传代，肝干细胞具有强大的增殖能力，即使经过基因修饰仍有可能传代，这为克服目前基因治疗中的主要问题开辟了新的途径。以肝干细胞作为载体具有一次性介入，永久性治疗的特点，且永生化的肝干细胞无致癌的危险性[F]。
基于以上研究成果，我们设想利用肝干细胞在肝脏汇管区中央静脉周围的靶向定植并在必要时分化补充受损或衰老的血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞的生物学特性，以腺相关病毒为载体将DcR3基因转入从雄性近交系Wistar大鼠骨髓中分离纯化的肝干细胞，将雌性近交系Wistar大鼠肝脏植入雌性近交系Lewis大鼠，同时将转染DcR3基因的肝干细胞经门静脉注入移植后的肝脏。DcR3基因随着肝干细胞的定植主要在汇管区持续表达，必要时部分随着肝干细胞的进一步分化而表达在血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞，从而在启动（主要）、攻击（次要）两个环节抑制排斥反应的发生。DcR3基因强大的免疫抑制作用被局限在肝脏之中，从而诱导出特异针对肝脏的移植耐受状态。
参考文献
1. Arnold B. Levels of peripheral T cell tolerance. Transplantation Immunology. 2002,10(2-3):109-114
2. Goddard S, Adams DH. New approaches to immunosuppression in liver transplantation. J astroenterol Hepatol.2002, 17(2):116-26
3. Petersen BE，Bowen WC，Patrene KD，et al．Bone mar row as a potential source of hepatic oval cells． Science．1999，284（5417）：1168－70
4. Mitaka T．Hepatic stem cells：from bone marrow cells to hepatocytes．Biochem Biophys Res Commun．2001，281（l）：l－5
5. Farber E．Similarities in the sequences of early histological changes Inced in the liver of the rat by ethionine，2-acetylaminofluorence，and 3-methyl-4-dimethyl aminoazobenzene．Cancer Res l955，16：142－8
6. Fujio K，Evans RP，Hu Z，et al．Expression of stem cell factor and its receptor，c-kit，ring liver regeneration from putative stem cells in alt rat．Lab Invest．1994，70（4）：511－6
7. Petersen BE，Goff JP，Greenberger JS，et al．Hepatic oval cells express the hematopoietic stem cell marker Thy-1 in the rat．Hepatology．1998，27（2）：433－45
8. Baumann U， Crosby HA，Ramani P，et al．Expression of the stem cell factor receptor c-kit in normal and diseased pediatric liver: identification of a human hepatic progenitor cell？ Hepatology．1999，30（l）：112－7
9. Lemmer ER， Shepard EG，Blakolmer K，et al．Isolation from human fetal liver of cells co-expressing CD34 haematopoietic stem cell and CAM 5.2 pancytokeratin markers．J Hepatol．1998，29（3）：450－4
10.Lagasse E，Connors H，AI- Dhalimy M，et al．Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo．Nat Med. 2000，6（11）：1229－34
11.Gao Z, McAlister VC, Williams GM. Repopulation of liver endothelium by bone-marrow-derived cells. Lancet.2001,357(9260):932-933.
12.Avital I，Inderbitzin D，Aoki T，et al．Isolation，characterization，and transplantation of bone marrow derived hepatocyte stem cells．Biochem Biophys Res Commun．2001，288（l）：156-64
13.Daly AK, Day CP, Donaldson PT. Polymorphisms in immunoregulatory genes: towards indivialized immunosuppressive therapy? Am J Pharmacogenomics. 2002, 2(1): 13-23
14.Pitti RM, Marsters SA, Lawrence DA, etal. Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer. Nature. 1998,396(6712): 699-703
A．Crosby HA, Gastroenterology,2001,120:534-544
B．姚 鹏,詹轶群,许望翔,等.细胞生长因子体外对大鼠肝干细胞的影响.中华肝脏病杂志,2003,11(1):33～36
C．赵春华(hsc3)
D.Alison MR.Liver 2001 21(6):376
E Suzuki A. Clonal identification Journal of cell boil,2002, 156(1):173
F Allain JE, Immortalization. Proc Natl Acad Sci,2002,99(6),3696
G Theise ND.The canals of .Hepatology ,1999,30(6):1425-1433
H Lagasse E, Connors H, Al-Dhalimy M, et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med. 2000 Nov;6(11):1229-34.
I Schwartz RE, Reyes M, Koodie L, et al. Multipotent alt progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells. J Clin Invest. 2002 May;109(10):1291-302.
J Danet GH, Luongo JL, Butler G, et al. C1qRp defines a new human stem cell population with hematopoietic and hepatic potential. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 6;99(16):10441-5. Epub 2002 Jul 24.
K Van der Kooy D, Weiss S. Why stem cells? Science. 2000 Feb 25;287(5457):1439-41.
L.PetersenBE,BowenWC,PatreneKD.etal..Science,1999,284∶1168 1170.
M.TheiseND,BadveS,SaxenaR,etal. incedmyeloablation.Hepatology,2000,31∶235 240.
N.TheiseND,NimmakayaluM,GardnerR,etal.Liverfrombonmarrowinhumans.Hepatology,2000,32∶11 16.0 O.AlisonMR,PoulsomR,JefferyR.etal..Nature,2000,406∶257.1
P.AvitalI,InderbitzinD,AokiT,etal.Isolation,lsBiochemBiophysResCommun,2001,288∶156 164.
2.项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题。（此部分为重点阐述内容）
2.1 研究内容
2.1.1构建携带DcR3基因的腺相关病毒载体，并将其转染AAV293细胞，收集AAV病毒颗粒备用。
2.1.2从雄性近交系Wistar大鼠股骨、胫骨抽取骨髓，分离出肝干细胞，用上述腺相关病毒颗粒转染，并进行表达鉴定。
2.1.3将雌性近交系Wistar大鼠肝脏植入雌性近交系Lewis大鼠，同时将转染的雄性近交系Wistar大鼠的肝干细胞经门静脉注入肝脏。
2.1.4根据Y染色体及AAV病毒载体自带的绿色荧光蛋白（GFP）标志确定转基因肝干细胞在供肝中的定植、分布情况。
2.1.5检测转入肝干细胞的DcR3基因在供肝中的表达情况。
2.1.6观测肝移植术后移植排斥反应的发生情况。
2.2研究目标：本课题拟构建携带DcR3基因的腺相关病毒，将其转染雄性近交系Wistar大鼠骨髓来源的肝干细胞；将雌性近交系Wistar大鼠肝脏植入雌性近交系Lewis大鼠，同时将转染DcR3基因的肝干细胞经门静脉注入移植后的肝脏；使DcR3基因在供肝中长期表达，从而诱导特异针对肝脏的移植耐受状态。探讨：(1)转基因肝干细胞在供肝中的定植、分布情况。(2)转入肝干细胞的DcR3基因在供肝中的表达情况。(3)转基因肝干细胞在供肝中的分布及其基因表达与移植耐受的关系。
2.3拟解决的关键问题
2.3.1腺相关病毒转染肝干细胞的效率：干细胞的基因转染难度较大，是本课题的关键环节之一。本课题成员（删去）于2001年用腺病毒成功感染了神经干细胞，成功率约 80%～90%，且经传代培养 12代后仍具干细胞特性。腺相关病毒转染效率高于腺病毒，转染的细胞类型较腺病毒更广泛。因此本课题组有能力完成腺相关病毒对肝干细胞的转染。
2.3.2转基因肝干细胞在供肝汇管区中定植的数量：肝干细胞在汇管区的定植数量与肝脏受到的损伤程度有关。损伤越重，肝干细胞在汇管区的定植数量越多，反之亦然。肝移植时肝脏缺血再灌注对肝脏已是一种损伤，为了进一步提高肝干细胞在汇管区的定植数量，可在冷保存时切除大鼠肝脏的一叶，然后完成肝移植。
3.拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）
3.1研究方案
3.1.1 DcR3基因的克隆，参照Pitti RM等介绍的方法进行。
3.1.2构建携带DcR3基因的腺相关病毒载体，并用其感染AAV－293细胞进行体外表达鉴定、收集AAV病毒颗粒备用。
3.1.3从雄性近交系Wistar大鼠股骨、胫骨抽取骨髓，分离肝干细胞并进行纯化、鉴定，参照Itzhak Avital等介绍的方法进行。
3.1.4腺相关病毒载体转染肝干细胞，采用直接感染方法。
3.1.5体外试验：表达DcR3基因的肝干细胞抑制FasL诱导淋巴细胞凋亡试验；表达DcR3基因的肝干细胞抑制FasL诱导的淋巴细胞趋化试验
3.1.6动物实验：大鼠肝移植采用袖套法，移植完成时将转染DcR3基因的肝干细胞经门静脉注入肝脏；分别于术后3天、7天、14天、21天、28天取血液及肝脏标本，采用常规生化法检测肝功能，Northern blot、Western blot检测DcR3基因在肝脏中的表达情况，免疫组化法检测受体CD4+、CD8+淋巴细胞在供肝中的浸润情况，TUNEL法检测供肝中细胞凋亡情况，常规石蜡切片HE染色观察移植排斥反应的发生情况。
3.2技术路线
3.3可行性分析
3.3.1理论上，骨髓来源的肝干细胞是肝脏汇管区卵圆细胞、嗜碱性小肝细胞的前体细胞。研究证明经门静脉注入的肝干细胞定植的肝脏汇管区的Hering小管，可分化为血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞。汇管区是肝移植排斥反应时CTL细胞首先浸润的区域，血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞是CTL细胞攻击的靶细胞。因此肝干细胞将转染的免疫抑制基因带入肝脏并汇管区及血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞中持续表达，从而诱导特异针对肝脏的移植耐受状态在理论上是可行的。
3.3.2本研究所涉及的技术均为成熟的免疫学技术；本研究所拥有本研究所需的设备和条件。
4.本项目的特色与创新之处。
本研究利用了肝干细胞在肝脏定植、分化的靶向性，将其作为免疫抑制分子的载体，使非特异性的免疫抑制分子的作用局限于肝脏之中，克服了免疫抑制分子作用范围过大的缺点，从而诱导特异针对肝脏的移植耐受状态。
5.年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）
年度研究计划
2005.01-2005.09 DcR3基因的克隆，构建携带DcR3基因的腺相关病毒载体备用。
2005.10-2006.06 分离、纯化、鉴定雄性近交系大鼠骨髓来源的肝干细胞，并用腺相关病毒进行转染；DcR3基因的体外表达鉴定；所转染的DcR3基因的体外功能实验。
2006.07-2007.06 完成肝移植的动物模型，将转染后的肝干细胞经门静脉注入肝脏。按期取肝脏标本，根据Y染色体标志染色及GFP，确定转基因肝干细胞在供肝中的定植、分布情况；检测转入肝干细胞的基因在肝脏中的表达情况；移植排斥反应的发生情况。
2007.07-2007.12 补充实验遗漏，整理实验资料，统计处理实验数据，撰写论文。
预期研究结果
1.证明转染DcR3基因的肝干细胞能在供肝汇管区及部分血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞中持续表达，同时诱导出长期的肝移植免疫耐受。
2.在国外学术期刊上发表论文2-3篇，在国内核心期刊发表论文6-8篇，并在国内学术会议交流。
(二）研究基础与工作条件
1.工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）
2月底至3月初出结果。
2.工作条件（包括已具备的实验条件，沿缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况。）
删去
3.申请人简历（包括申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务。）
删去
（三）经费申请说明（要求按照《国家自然科学基金经费管理办法》认真填写，购置5万元以上固定资产及设备等，须逐项说明与项目研究的直接相关性及必要性。）
（四）其他附件清单（附件材料复印后随纸质《申请书》一并上交）（随纸质申请书一同报送的附件清单，如：具有中级技术职称申请者的推荐信或在职研究生申请项目的导师推荐信等。）
『贰』 肝癌产生的分子机制是什么
原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,HCC)是指肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌，是恶性程度及转移率很高的肿瘤之一。近年来，随着分子生物学技术的不断进步，对HCC发病机制的研究愈发深入。
1 抑癌基因与HCC
HCC的生成涉及许多基因的变化，基因变化的积累引起控制细胞生长和分化机制的紊乱，而生长分化间的平衡受控于两类基因：癌基因和抑癌基因。抑癌基因参与细胞增殖和、凋亡和DNA复制等过程，其表达的失控导致HCC的发生和发展。
1.1 WWOX基因(WWdomain containing oxidorectase，WWOX) 位于染色16q23.3q24 ，其编码蛋白具有两个WW结构域，以及一个短链脱氢酶/还原酶结构(shortchain dehydrogenase/rectase domain，SRD)。它能够与cJun、 TNF、p53、p73、AP2γ及 E2F1等相互作用，通过转录抑制及促进细胞凋亡来达到抑癌的目的，而其中促细胞凋亡的功能显得尤为重要。WWOX的抑癌机制为：①将转录因子AP2γ隔离于细胞质之内并抑制其转录活性[1];②触发p73重分布并抑制其转录活性，激活细胞凋亡[2];③上调P53并下调Bcl2 和BclXL，促进细胞凋亡[3]。
WWOX基因的缺失突变或移码突变导致其不同结构域的部分或完全丧失，形成不同形式的WWOX转录产物。WWOX的多种错义突变及单核苷酸多态性(SNP)在多种肿瘤细胞系被确定，黄曲霉素B1所致的HCC中可见位于16号染色体内脆弱性部位FRA16D的杂合性丢失。WWOX的表达增强能够抑制成纤维细胞生长因子FGF2介导的细胞增殖，并增强cJun氨基端激酶抑制剂SP600129所诱导的细胞凋亡[4]。
1.2 Parkin基因 位于染色体脆性位点FRA6区域，此区域也是突变重排的热点。Parkin属于RBR蛋白家族，与泛素相关蛋白分解途径有关。Parkin的抑癌机制为：①Parkin的缺失抑制细胞凋亡蛋白caspase的活化，并以卵泡抑素依赖性的方式使肝细胞抵抗凋亡，促进肝肿瘤的发生[5];②由于FRA6E 的普通脆弱性部位(FRA6E common fragile site)不稳定性导致的Parkin表达缺失，将引起细胞快速增殖及细胞对凋亡的敏感性的减弱[6]。
Parkin基因缺失导致肝细胞增殖及肉眼可见的HCC。微阵列分析显示Parkin的缺失导致肝脏基因表达的改变[5]。Wang等[7]证实HCC组织中Parkin的表达比正常肝组织低，将Parkin基因转染到Hep3B细胞中，可以增加其对凋亡的敏感性，且对其生长具有负性调节作用。因此推测Parkin的缺失将促进肝癌的发展。
1.3 RB基因 RB作为转录因子E2F/DP 家族抑制物，调节细胞增殖中的基因表达，它的失活将导致细胞周期的异常转变。RB的抑癌机制为：①通过维持染色体的稳定性来抑制肿瘤的发生[8];②与转录因子E2F结合从而影响其转录活性，抑制细胞增殖[10]。
总的来说，RB的失活在肿瘤发生的早期起到促进细胞增殖的作用。然而，细胞培养模型显示，RB的失活导致细胞适度的增殖，而RB缺陷则使DNA复制与细胞周期解偶联，导致基因组的不稳定。以上机制尚不清楚，可能与RB的目标信号途径有关。在小鼠的肝癌模型中，RB基因丢失并不会刺激细胞增殖，但却使DNA的复制周期出错，导致异常的染色体倍数。以DNA损伤剂二乙基亚硝胺作为肿瘤促发物制作老鼠肝癌模型，发现RB的丧失将大大增加肿瘤的易感性，这是由于对DNA损伤的不适当应答加速了基因组稳定性的丧失[8，9]。
1.4 第10染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因 (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten , PTEN) 位于染色体10q23.3，是细胞内磷脂酰肌醇三磷酸水平的负调节因子。PTEN的抑癌机制为：①抑制局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)和SH2包含蛋白(SH2containing protein, Shc)磷酸化及RAS介导的MAP激酶的活化，抑制细胞生长分化[11];②使 PIP3去磷酸化，抑制 PI3K/ PKB/ AKT 信号通路，阻止细胞生长及促进细胞凋亡[12]。
HCC与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路的抑制有关。Sieghart等[13]发现，47%的HCC中PTEN的减少或缺失与mTOR通路中磷酸化蛋白的表达负相关。另外，PTEN的启动子活性丧失造成其表达减少，但Wang等[14]证实PTEN的失活并不仅仅是因为突变或启动子甲基化，可能还与其后续调节有关。PTEN表达的减少意味着HCC的进展及预后不良，这可能与VEGF呈负相关的表达有关[15]。
不饱和脂肪酸通过激活mTOR与核因子NFkappaB形成的信号复合物来抑制PTEN在肝癌细胞HepG2中的表达。表达下调的PTEN通过对细胞中脂肪酸的输入，酯化及输出作用诱发肝细胞脂肪变。由此证明，肝脂肪变是由于暴露于高水平的不饱和脂肪酸的肝细胞中PTEN表达的改变所介导的[16]。PTEN表达的下调及P53的过度表达参与了HCC的发病机制。它们与增殖细胞核抗原PCNA的高表达，HCC的去分化及HCC的早期阶段有关[17]。非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)的患者可以逐渐进展为肝硬化甚至肝癌。在PTEN缺失型小鼠中，已观察到能产生肝肿大及脂肪性肝炎，并逐渐发展为肝纤维化及肝癌，类似于人类NASH。据此认为，PTEN的缺失导致了这一系列的变化[18]。
2 癌基因与HCC
2.1 陷阱受体3 (decoy receptor 3, DcR3) DcR3是一种肿瘤坏死因子受体超家族的成员，在肿瘤组织中特异性表达。它与肿瘤细胞的凋亡有关，可能在肿瘤的发生及进展中起到关键的作用。DcR3致癌机制为：①抑制FasL及Lt 样诱导蛋白(LTrelated incible ligand, LIGHT)介导的细胞凋亡[19];②DcR3不仅帮助肿瘤细胞逃避免疫监视，而且可以通过阻滞TNF样细胞因子1A(TNFlike cytokine 1A, TL1A)的功能来诱导血管生成[20];③通过上调粘附分子及炎性趋化因子的表达来增强单核细胞对内皮细胞的粘附[21]。表达DcR3的HCC细胞其凋亡指数较对照组明显降低，在肿瘤转移20个月以内的HCC中检出率为100%，且与血清AFP及门静脉肿瘤栓塞的发生率正相关[22]。另外，它不仅作为陷阱受体中和免疫系统对肿瘤的攻击，而且在炎症、先天免疫与肿瘤形成的联系中起到关键作用。
2.2 垂体瘤转化基因1(pituitary tumor transforming gene 1，PTTG1/Securin) PTTG1表达细胞周期调节蛋白Securin，它能够抑制姐妹染色单体的分离，参与细胞转化和肿瘤形成。PTTG1与DNA的修复及反式激活cmyc, bax 和 p53参与的不同的细胞信号通路有关。PTTG1的致癌机制为：①通过Securin与p53相互作用，阻碍p53与DNA的结合并抑制其转录活性[22];②抑制p53的功能，促进细胞凋亡[23];③刺激细胞过度表达βFGF、VEGF和IL8，促进细胞生长和血管形成[24]。p53在应激条件下对基因表达的调节起到至关重要的作用。Securin是p53转录活性的负调节因子。PTTG1/Securin的丧失将导致p53蛋白的半衰期的改变。另外，PTTG1介导的FGF-2的上调与瘤内的微血管密度有关。研究发现，PTTG1在HCC中表达明显增加，可作为术后生存率的预测指标[25]。
3 生长因子与HCC
3.1 肝细胞生长因子( hepatocyte growth factor,HGF) HGF通过刺激细胞的运动性及血管生成效应来促进肿瘤的生长，还能通过转录因子Egr1促进肝细胞癌中5α还原酶1的转录来调节类固醇的代谢，可能成为女性肝癌发生高风险因素[26]。
3.2 转化生长因子(transfoming growth factor,TGF) TGF在调节细胞生长与分化，血管形成，细胞外基质形成，免疫抑制及肿瘤发生中起到重要作用。肝癌细胞中TGFβ表达的异常与HCC的分化程度及HBV复制有关，但与肿瘤的大小及数量无关[27]。TGFβ能够上调Rac依赖性NADPH氧化酶Nox4，通过氧化应激方式诱导肝细胞凋亡。敲除Nox4基因后，会引起TGFβ诱导的凋亡受损，引起HCC凋亡抵抗[28]。
3.3 血小板源性生长因子(plateletderived growth factor，PDGF) TGFβ能够通过上调血小板源性生长因子A(PDGFA)及PDGF受体来诱导PDGF的分泌。PDGF在肿瘤的形成过程中为肿瘤提供粘附及转移的性质并刺激其增殖[29]。
4 病毒相关基因与HCC
HBV及HCV被公认为是HCC的重要发病因素之一，其导致肝细胞转化的机制仍然未明，至今仍未发现与HBV及HCV特异性相关的人类基因的存在。目前认为肝细胞损伤后的复制修复导致了与肝癌发生相关的随机突变的积累。
4.1 HBV HBx基因与肝细胞癌的发生发展密切相关。HBx是一种反式激活因子，能够通过蛋白间的相互作用间接激活多种细胞与病毒的启动子。HBx的构象多变性也许可以解释其功能的复杂性，即它能够与一系列信号蛋白，转录调节因子及核酸发生作用。在具有恶性表型的HCC中常可见细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的过度表达，而HBx通过NFκB2(p52)/BcL3复合物的介导上调Cyclin D1的表达[30]。
许多与HBx表达有关的细胞信号转导活动及其激发的病毒复制与酪氨酸激酶Pyk2和Src参与的钙离子信号通路有关。HBx可以激活FAK及Pyk2/FAK激酶家族的其它成员。而FAK的激活对于HBx的功能起到非常重要的作用。FAK的抑制将阻碍HBx对Src及下游信号转导的激活，以及对NFκB和AP1依赖性转录的激活，并阻碍HBV DNA的复制。HBx激活的FAK可能成为HBV相关性肝癌的潜在辅助因子[31]。
4.2 HCV HCV感染导致肝癌的发病机制仍未完全明了。病毒蛋白与宿主细胞间的相互作用可能在HCC的发生中起到重要的作用，并且独立于肝硬化所致的肝癌。
4.2.1 HCV Core 核心蛋白Core能够干扰和转变细胞生长周期的各个阶段，导致有丝分裂的异常。Core能够与双链RNA依赖蛋白激酶PKR相互作用，而PKR参与细胞生长的许多过程，如凋亡。 PKR能够被IFN激活，并磷酸化真核翻译起始因子2A(eukaryotic initiation factor2A，eIF2A)来抑制细胞蛋白的合成，从而抑制细胞生长。Core诱导PKR的Thr446位磷酸化，这将改变PKR对各种底物的活性，包括阻止细胞凋亡。
细胞生长周期各个不同阶段的检查点(checkpoint)的破坏是肿瘤形成的一个重要方面。Core能通过加强P53与其DNA结合位点的亲和力或增强其转录激活的活性而并不增加P53的表达来增强P53的功能[32]。虽然在细胞核中找到少量的Core，但其主要分布在细胞质内，而P53则定位于细胞核内。因此，P53功能的加强并不能完全由以上机制来解释。
虽然研究证实了Core的以上功能，但具体机制仍然未明。事实上，信号通路的复杂性及肝细胞癌变过程的多阶段性显示了肝癌的发生是一个基因上调与下调的序贯组合。这些基因受到影响并不意味着它们都参与了癌变的发生。但要强调的是，Core确实能够改变细胞信号传导途径。
4.2.2 HCV NS5A 非结构基因NS5A能够通过PKR通路来激活NFkappaB因子导致炎症，还能够直接抑制PKR通路。NS5A中的重要序列ISDR能够与PKR结合，阻止其形成二聚物，导致其功能的丧失，并阻止eIF2的磷酸化。然而有研究证实，在表达NS5A的细胞系中，NS5A对PKR似乎并没有明显的影响。由于PKR遍布于细胞质内，而HCV的其它蛋白的共同表达使得NS5A定位于细胞器质膜表面，从而减少N5SA与PKR结合的可能性。另外，NS5A还能与P53的结合导致p21的下调并促使细胞生长。
『叁』 哪位大佬有AIMiner(智能挖矿软件) 安装包
软件介绍
IMiner智能挖矿是由比特威风（BITVF）推出的一款一键式挖矿优化工具。它能够支持挖以太坊，以太经典，零币，红烧肉，门罗币等多种币种，也支持同时双挖币种DCR和SC等，支持在Nvidia和AMD显卡。提高了N卡和A卡的挖矿算力，支持矿机监控。
所需工具：点击下载：AIMiner
AIMiner对底层GPU显卡优化挖矿算法，统计硬件系统分别挖每种币的算力、A卡BIOS设置情况、GPU显卡超频情况等数据做出一个智能化的优化挖矿设置。软件默认提供了各种币种时间上主流的矿池和收益查询等。
功能介绍
1、支持双挖币种
2、支持N卡和A卡
3、支持矿机监控
4、支持Windows
5、提高挖矿算力
6、一键式挖矿
『肆』 不以规矩，不成方圆
《不以规矩，不能成方圆》出自《孟子》的《离娄章句上》。 孟子要求当政者实施仁政的鼓吹与呐喊。具体落实到两个方 面：一是“法先王”；二是选贤才。所谓“不以规矩，不能成方圆”的说法成为了人们在生活中常用的格言警句。
详见：http://ke..com/link?url=_-0KdPk7j_4rQPo1__wMCmMomxc5HHC82g5ZyLG9J-eYPVAPeJwmDcr3-SHedqroLRzcG-VAu
『伍』 求邓紫棋新歌 【另一个童话 ] 【倒数】 【错过不错] 谢谢！
过的不错
『陆』 3dCR灯罩怎么调
2、调节灯罩材质：（1）选择一个材质球并调整为VR材质，在其漫射颜色通道中加入一张类似于右图图样的“贴图”；（2）同时在折射贴图通道中也加入以上那张同样的贴图，改其折射率为1.1，折射光泽度为0.1，折射细分值为20左右，勾选使用插值、影响阴影及影响Alpha。
3、也可以给灯光的稍微加一点暖色
『柒』 化学方程式如何配平呐
简单得很就用最小公倍数法
『捌』 什么是POW和POS，二者区别联系
POW：全称Proof of Work，工作量证明。
POS：全称Proof of Stake，权益证明。
区别是：
1、POW机制：工作量证明机制即对于工作量的证明，是生成要加入到区块链中的一笔新的交易信息(即新区块)时必须满足的要求。在基于工作量证明机制构建的区块链网络中，节点通过计算随机哈希散列的数值解争夺记账权，求得正确的数值解以生成区块的能力是节点算力的具体表现。
2、POS机制：权益证明要求证明人提供一定数量加密货币的所有权即可。权益证明机制的运作方式是，当创造一个新区块时，矿工需要创建一个“币权”交易，交易会按照预先设定的比例把一些币发送给矿工本身。权益证明机制根据每个节点拥有代币的比例和时间，依据算法等比例地降低节点的挖矿难度，从而加快了寻找随机数的速度。
(8)DCR3矿机扩展阅读：
比特币（BitCoin）的概念最初由中本聪在2009年提出，根据中本聪的思路设计发布的开源软件以及建构其上的P2P网络。比特币是一种P2P形式的数字货币。点对点的传输意味着一个去中心化的支付系统。
与大多数货币不同，比特币不依靠特定货币机构发行，它依据特定算法，通过大量的计算产生，比特币经济使用整个P2P网络中众多节点构成的分布式数据库来确认并记录所有的交易行为，并使用密码学的设计来确保货币流通各个环节安全性。P2P的去中心化特性与算法本身可以确保无法通过大量制造比特币来人为操控币值。
『玖』 计算电感值
2*PAI*F*L只是感抗
阻抗你要考虑 电阻 电感 电容对交流的阻碍作用
参考资料：http://bbs.big-bit.com/forum.php?mod=viewthread&tid=450257
请采纳答案！