DCR3礦機
『壹』 求一醫學標書的樣本
目前，移植排斥反應仍然是制約肝移植療效的主要原因。雖然由於免疫抑制劑的臨床應用，肝移植的1年的存活率大幅度提高，已超過了80%。但是終生服用免疫抑制劑不僅成為患者沉重的經濟負擔，而且造成機體的免疫功能低下，可能促進肝炎及腫瘤復發，誘發感染、腫瘤等疾病。因此，找尋誘導特異性移植耐受的新方法，是克服移植排斥反應的最佳途徑。
特異性移植耐受是指在無需使用免疫抑制葯物的情況下，受者的免疫系統對同種異體或異種供體抗原長期不發生免疫反應，而對其它抗原可發生正常免疫應答的狀態。目前認為，誘導機體產生免疫耐受涉及免疫清除、免疫失能、免疫抑制和免疫忽視四類機制[1]。根據以上誘導免疫耐受的機制，學者們發展出許多誘導移植耐受的新方法[2]：(1)在胸腺內直接注射表達供體抗原的細胞，在胸腺內通過克隆清除誘導免疫耐受。(2)利用骨髓移植造成造血細胞嵌合體誘導耐受。(3)阻斷T細胞活化的共刺激信號通路。(4)輸注供體樹突狀細胞(Dentritic cell，DC)誘導耐受。(5)針對T細胞粘附和活化相關分子的單克隆抗體：抗T細胞及T細胞亞群的單抗；抗粘附分子或細胞因子的單抗。(6)其它特異性免疫抑制的方法：合成肽阻斷TCR對同種異體抗原的識別；合成肽阻斷趨化因子及其受體。以上方法均不同程度地誘導了對供體抗原的耐受，但它們存在如下不足：(1)成年人胸腺已經萎縮，無法在胸腺內直接注射表達供體抗原的細胞，故該方法適用范圍大大受限。(2)供體骨髓移植能誘導部分耐受，但不易控制嵌合程度，移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的發生率大大增加。(3)DC誘導的淋巴細胞失能狀態可通過給予外源性IL-2而逆轉；感染或其它因素引起機體強烈的免疫應答，產生大量的IL-2等細胞因子也可以通過旁效應解除失能的細胞克隆；失能狀態的維持需要抗原的持續存在，抗原的去除也能逆轉失能。(4)阻斷協同刺激通路、應用針對T細胞粘附和活化相關分子的單克隆抗體、合成肽阻斷TCR對同種異體抗原的識別、阻斷趨化因子及其受體等方法能誘導出確切的免疫抑制，但是其作用范圍是全身性的、非特異性的，且一旦中止阻斷劑的供給，則移植耐受消失。總之， 目前誘導移植耐受的方法存在非特異性、容易逆轉、實際操作困難等缺陷。
肝移植排斥反應啟動時，首先表現為淋巴細胞對匯管區中央靜脈周圍的浸潤，隨著排斥反應的進展，淋巴細胞的損傷導致小葉間膽管上皮細胞、中央靜脈內皮細胞的炎症，最後波及匯管區周圍的肝實質細胞，造成廣泛的肝臟炎性反應。因此肝移植排斥反應的過程是從匯管區啟動，進而擴展至小葉間膽管上皮細胞、中央靜脈內皮細胞、匯管區周圍的肝實質細胞。移植排斥反應發生時，CTL細胞在活化後可以通過以下兩條途徑殺傷靶細胞：(1)穿孔素/顆粒酶途徑。(2)Fas/FasL途徑：在CTL細胞識別靶細胞後，細胞表面表達的高水平FasL與靶細胞表面的Fas相互識別，通過Fas觸發靶細胞內部的凋亡程序，使靶細胞發生程序性死亡。體外實驗證實兩條途徑相互獨立。然而體內實驗證實單一阻斷Fas/FasL途徑即可抑制CTL對靶細胞的殺傷，其原因可能與體內環境有關28.
誘騙受體3(Decoy receptor 3，DcR3)是一種新發現的可結合FasL的可溶性TNFR超家庭成員，RNA印跡表明DcR3 mRNA 表達於胎肺、腦、肝及成人脾、結腸和肺，特別是在肺癌和結腸癌細胞系的表達很高，也可由T細胞絲裂原激活的外周血單核細胞分泌。DcR3 分子質量為35kDa，肽鏈長300個氨基酸殘基。DcR3 的配體是LIGHT、FasL、TL1A。其主要作用有：(1)與Fas競爭性結合FasL，阻斷FasL所誘導的細胞凋亡，這一作用可以減弱CTL和NK細胞對靶細胞的殺傷[14]。(2)通過抑制LIGHT與HveA 或TR2之間的雙向信號轉導、TL1A至DcR3的單向信號轉導來抑制T細胞激活。7 (3)抑制CXCL12/基質細胞來源的因子1α(SDF-1α) 、FasL對T細胞的趨化作用，從而減少CD4+和CD8+T細胞對腫瘤的浸潤。25. 27．(4)通過調節DC分化和成熟從而抑制CD4+ T細胞增生。20．(5)抑制T細胞偽足形成，阻止它們形成不可分離的細胞簇從而調節T細胞與其它細胞如APC的相互作用。7
因此根據其作用機理，人們推測其可能有以下四方面的作用(1)腫瘤細胞逃避免疫監視。（2）抗炎作用。(3)致癌作用。（4）誘導移植耐受。目前的研究工作已經肯定DcR3基因對腫瘤細胞逃避免疫監視、抑制炎症反應的作用，但DcR3基因的高表達與細胞癌變無相關性，不是癌基因。Wu等證實DcR3減少了FasL、IFN-γ誘導的胰島細胞凋亡及胰島素釋放，可防止同種異基因胰島移植時的胰島原發性無功能。2Zhang等於心臟移植術前一天開始連續7天靜脈注射DcR3，小鼠心臟存活時間比對照組延長3.3天，提示DcR3可以減弱T細胞對同種異體抗原的反應。24我們利用腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)（AAV Helper－Free System, Stratagene 公司）作為DcR3基因的載體，將AAV病毒顆粒從門靜脈、肝動脈、膽管注入冷保存時的供肝，成功實現了DcR3基因在供肝的表達，在沒有使用免疫抑制劑的情況下，供肝正常存活了105天（目前仍然存活，繼續觀察中），而對照組僅存活了15天（見研究工作基礎）。AAV Helper－Free System的特點有：病毒載體產生、效價滴定階段均不需野生型腺病毒共感染，因此有極高的生物安全性、宿主的免疫反應極小；AAV可感染的細胞類型廣泛，感染不依賴於活躍的細胞分裂；AAV病毒滴度高，常規可達107病毒顆粒/ml，經濃縮可達1012病毒顆粒/ml；AAV在允許復制的條件下可在染色體外復制，在不能復制的條件下可以5-10%的效率定點整合入宿主19號染色體的一個2-4kb的區域，因此AAV被證明有應用於基因長期表達的價值。我們目前的研究工作的特色有：（1）證明了腺相關病毒攜帶的DcR3基因可以誘導肝移植耐受。(2)採用AAV Helper－Free System克服了逆轉錄病毒載體轉導效率低、隨機整合入受者染色體中而致腫瘤的危險的缺點[1]以及腺病毒載體雖然有較高的轉導率,但因不能在染色體外復制或整合入受者染色體中,目的基因只能一過性表達的缺點[2]。我們目前研究工作的缺陷有：（1）DcR3基因僅在肝臟血管內皮細胞、膽管上皮細胞表達，而急性排斥反應啟動時CTL細胞首先浸潤的是匯管區的中央靜脈周圍，因此它尚不能阻止急性排斥反應的啟動，僅能阻止CTL細胞血管內皮細胞、膽管上皮細胞的攻擊。（2）DcR3基因轉染的血管內皮細胞、膽管上皮細胞是成熟的細胞。雖然攜帶DcR3基因的AAV可在染色體外復制或整合入宿主基因組而使DcR3基因存在長期表達的可能，但是成熟細胞存在新老交替，DcR3基因的表達隨著細胞的死亡而消失。因此為了完善我們目前的研究工作，我們需要作以下的改進：（1）將DcR3基因的表達定位於匯管區中央靜脈周圍，抑制排斥反應的啟動。如能進一步將DcR3基因表達於血管內皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞，則更能防止個別活化的CTL細胞對它們的攻擊，從而形成抑制排斥反應的「雙保險」。（2）實現DcR3基因的持續表達。
肝幹細胞（Hepatic Stem Cell，HSC）是指具有自我更新能力和具有分化形成肝細胞與膽管細胞潛能的原始細胞。最近有人證實它尚可分化為血管內皮細胞(Gao Z, McAlister VC, Williams GM. Repopulation of liver endothelium by bone-marrow-derived cells. Lancet. 2001 Mar 24;357(9260):932-3.) [11]。肝幹細胞的基本特徵可概括為兩點：①具有多向分化能力，可向肝細胞、膽管上皮細胞、肝臟血管內皮細胞分化。②具有自我更新與自我維持能力，對肝臟損傷或疾病產生反應並進行修復。其形態特點是細胞體積小、核大而胞質少、呈卵圓形、具有特殊的表面標志如AFP、肝細胞標志（白蛋白）、膽管上皮細胞標志（CK7、CK19）以及肝細胞、膽管上皮細胞共有的標志(CK8、CK18)。目前有人證實其尚有血管內皮細胞的標志。
該類細胞不僅在胚胎肝組織中存在，而且在成年肝組織中也存在。肝內的肝幹細胞稱為卵圓細胞(Hepatic Oval Cell，HOC)或小肝細胞。它們在正常情況下位於肝臟匯管區的Hering小管[D]，當肝臟受到損傷（肝毒性葯物、手術、創傷、缺血再灌注等）時，它們迅速增生分化，補充受損的肝細胞、膽管上皮細胞、肝臟血管內皮細胞分化，因而被稱為肝幹細胞池[A]。目前大量文獻證實，肝臟損傷時，肝臟有三個水平的細胞修復：肝細胞、Hering 小管的雙向幹細胞、Hering小管周圍的來自骨髓的肝幹細胞。骨髓來源的幹細胞可定居於Hering小管周圍，在肝臟損傷時發揮修復作用[K]。Theise ND等通過三維觀測得出Hering 小管、匯管區周圍是肝幹細胞存在的場所的結論[G]。Petersen 證實肝內存在骨髓來源的幹細胞，Theise 大鼠2%，人4-40%。Alison0.5-2%(hsc8,78,79)。Lagasse 30%.認為Hering管可能是人肝幹細胞起源分化及滯留場所(TheiseND,SaxenaR,PortmannBC,etal.[J].Hepa-tology,1999,30:1425-1433.)
肝幹細胞的肝外來源包括胰腺的上皮細胞、胰島前體細胞、骨髓造血幹細胞[3,4]。自1999年Petersen等發現肝卵圓細胞可來源於骨髓後,從骨髓細胞中鑒定肝幹細胞成為近年研究的熱點。目前研究證實從骨髓中分離純化的造血幹細胞的多個亞群在一定的微環境或細胞因子的誘導下可分化為肝幹細胞[B]。目前,在骨髓中已發現多種細胞亞群具有分化為肝細胞的潛能,如KTLS細胞(c-kithighThylowLin-Sca-1+)[H]、β2-m-Thy-1+細胞[12]、CD44-CD45-HLA-c-kit-的多能成體前體細胞(multipotent alt progenitor cells, MAPC)[I]及C1qRp+細胞(Lin-CD45+CD38-CD34+/-)[J]等。這些細胞均涉及多個不同的表面標志,可能代表著骨髓幹細胞的不同發育階段或譜系中的不同分支。這些細胞因子肯定存在於細胞的微環境中，包括細胞外基質中參與粘附過程的信號分子以及參與正常細胞發育、分化、成熟的細胞因子[B] [E]。Petersen 等[L]、Theise等[M,N]和Alison等[O]的研究相繼指出,骨髓幹細胞或造血幹細胞能夠在鼠肝內轉化成為肝卵圓細胞甚至成熟的肝細胞和膽管細胞,並同時證明這種現象也存在於人類體內。用高濃度的肝細胞生長因子(HGF)誘導體外培養的大鼠骨髓細胞,RT-PCR檢測到白蛋白及AFP的表達,免疫細胞化學也證實了經誘導的細胞出現了AFP、白蛋白及CK8/18等肝前體細胞的特徵性表達。應用磁株細胞篩選法分離人或大鼠骨髓細胞中的β2m-Thy-1+細胞,能夠表達肝細胞的特徵[P]。這些骨髓來源的肝幹細胞(BDHSC)肝內移植後很快就整合入肝板,並且分化為成熟的肝細胞,而在體外培養的過程中加入膽汁化血清可促進它們向肝細胞方向分化。蔡雲峰等用免疫磁珠法成功分離出骨髓幹細胞的多個亞群，並證明大鼠骨髓內β2微球蛋白陰性(β2 m- ) 細胞經體外培養誘導後呈多角形細胞表現, 白蛋白、AFP、 CK8 / 1 8表達陽性，其他幹細胞類型未見類似變化。提示該亞群骨髓幹細胞有向肝幹細胞分化的能力。我們參照他們介紹的方法成功分離了1.5×105數量級的肝幹細胞純度為95%，培養7天後可達2×106數量級。經免疫組化染色證明其有肝細胞、膽管上皮細胞、血管內皮細胞的特異性標志，因此推測其可能分化為以上3種細胞（見研究工作基礎）。這些研究結果都說明骨髓細胞中存在有能分化為肝細胞的幹細胞群。
肝臟基因治療的一大難題是被用作基因修飾的成熟肝細胞在體外不易擴增和傳代，肝幹細胞具有強大的增殖能力，即使經過基因修飾仍有可能傳代，這為克服目前基因治療中的主要問題開辟了新的途徑。以肝幹細胞作為載體具有一次性介入，永久性治療的特點，且永生化的肝幹細胞無致癌的危險性[F]。
基於以上研究成果，我們設想利用肝幹細胞在肝臟匯管區中央靜脈周圍的靶向定植並在必要時分化補充受損或衰老的血管內皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞的生物學特性，以腺相關病毒為載體將DcR3基因轉入從雄性近交系Wistar大鼠骨髓中分離純化的肝幹細胞，將雌性近交系Wistar大鼠肝臟植入雌性近交系Lewis大鼠，同時將轉染DcR3基因的肝幹細胞經門靜脈注入移植後的肝臟。DcR3基因隨著肝幹細胞的定植主要在匯管區持續表達，必要時部分隨著肝幹細胞的進一步分化而表達在血管內皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞，從而在啟動（主要）、攻擊（次要）兩個環節抑制排斥反應的發生。DcR3基因強大的免疫抑製作用被局限在肝臟之中，從而誘導出特異針對肝臟的移植耐受狀態。
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2.項目的研究內容、研究目標，以及擬解決的關鍵問題。（此部分為重點闡述內容）
2.1 研究內容
2.1.1構建攜帶DcR3基因的腺相關病毒載體，並將其轉染AAV293細胞，收集AAV病毒顆粒備用。
2.1.2從雄性近交系Wistar大鼠股骨、脛骨抽取骨髓，分離出肝幹細胞，用上述腺相關病毒顆粒轉染，並進行表達鑒定。
2.1.3將雌性近交系Wistar大鼠肝臟植入雌性近交系Lewis大鼠，同時將轉染的雄性近交系Wistar大鼠的肝幹細胞經門靜脈注入肝臟。
2.1.4根據Y染色體及AAV病毒載體自帶的綠色熒光蛋白（GFP）標志確定轉基因肝幹細胞在供肝中的定植、分布情況。
2.1.5檢測轉入肝幹細胞的DcR3基因在供肝中的表達情況。
2.1.6觀測肝移植術後移植排斥反應的發生情況。
2.2研究目標：本課題擬構建攜帶DcR3基因的腺相關病毒，將其轉染雄性近交系Wistar大鼠骨髓來源的肝幹細胞；將雌性近交系Wistar大鼠肝臟植入雌性近交系Lewis大鼠，同時將轉染DcR3基因的肝幹細胞經門靜脈注入移植後的肝臟；使DcR3基因在供肝中長期表達，從而誘導特異針對肝臟的移植耐受狀態。探討：(1)轉基因肝幹細胞在供肝中的定植、分布情況。(2)轉入肝幹細胞的DcR3基因在供肝中的表達情況。(3)轉基因肝幹細胞在供肝中的分布及其基因表達與移植耐受的關系。
2.3擬解決的關鍵問題
2.3.1腺相關病毒轉染肝幹細胞的效率：幹細胞的基因轉染難度較大，是本課題的關鍵環節之一。本課題成員（刪去）於2001年用腺病毒成功感染了神經幹細胞，成功率約 80%～90%，且經傳代培養 12代後仍具幹細胞特性。腺相關病毒轉染效率高於腺病毒，轉染的細胞類型較腺病毒更廣泛。因此本課題組有能力完成腺相關病毒對肝幹細胞的轉染。
2.3.2轉基因肝幹細胞在供肝匯管區中定植的數量：肝幹細胞在匯管區的定植數量與肝臟受到的損傷程度有關。損傷越重，肝幹細胞在匯管區的定植數量越多，反之亦然。肝移植時肝臟缺血再灌注對肝臟已是一種損傷，為了進一步提高肝幹細胞在匯管區的定植數量，可在冷保存時切除大鼠肝臟的一葉，然後完成肝移植。
3.擬採取的研究方案及可行性分析。（包括有關方法、技術路線、實驗手段、關鍵技術等說明）
3.1研究方案
3.1.1 DcR3基因的克隆，參照Pitti RM等介紹的方法進行。
3.1.2構建攜帶DcR3基因的腺相關病毒載體，並用其感染AAV－293細胞進行體外表達鑒定、收集AAV病毒顆粒備用。
3.1.3從雄性近交系Wistar大鼠股骨、脛骨抽取骨髓，分離肝幹細胞並進行純化、鑒定，參照Itzhak Avital等介紹的方法進行。
3.1.4腺相關病毒載體轉染肝幹細胞，採用直接感染方法。
3.1.5體外試驗：表達DcR3基因的肝幹細胞抑制FasL誘導淋巴細胞凋亡試驗；表達DcR3基因的肝幹細胞抑制FasL誘導的淋巴細胞趨化試驗
3.1.6動物實驗：大鼠肝移植採用袖套法，移植完成時將轉染DcR3基因的肝幹細胞經門靜脈注入肝臟；分別於術後3天、7天、14天、21天、28天取血液及肝臟標本，採用常規生化法檢測肝功能，Northern blot、Western blot檢測DcR3基因在肝臟中的表達情況，免疫組化法檢測受體CD4+、CD8+淋巴細胞在供肝中的浸潤情況，TUNEL法檢測供肝中細胞凋亡情況，常規石蠟切片HE染色觀察移植排斥反應的發生情況。
3.2技術路線
3.3可行性分析
3.3.1理論上，骨髓來源的肝幹細胞是肝臟匯管區卵圓細胞、嗜鹼性小肝細胞的前體細胞。研究證明經門靜脈注入的肝幹細胞定植的肝臟匯管區的Hering小管，可分化為血管內皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞。匯管區是肝移植排斥反應時CTL細胞首先浸潤的區域，血管內皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞是CTL細胞攻擊的靶細胞。因此肝幹細胞將轉染的免疫抑制基因帶入肝臟並匯管區及血管內皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞中持續表達，從而誘導特異針對肝臟的移植耐受狀態在理論上是可行的。
3.3.2本研究所涉及的技術均為成熟的免疫學技術；本研究所擁有本研究所需的設備和條件。
4.本項目的特色與創新之處。
本研究利用了肝幹細胞在肝臟定植、分化的靶向性，將其作為免疫抑制分子的載體，使非特異性的免疫抑制分子的作用局限於肝臟之中，克服了免疫抑制分子作用范圍過大的缺點，從而誘導特異針對肝臟的移植耐受狀態。
5.年度研究計劃及預期研究結果。（包括擬組織的重要學術交流活動、國際合作與交流計劃等）
年度研究計劃
2005.01-2005.09 DcR3基因的克隆，構建攜帶DcR3基因的腺相關病毒載體備用。
2005.10-2006.06 分離、純化、鑒定雄性近交系大鼠骨髓來源的肝幹細胞，並用腺相關病毒進行轉染；DcR3基因的體外表達鑒定；所轉染的DcR3基因的體外功能實驗。
2006.07-2007.06 完成肝移植的動物模型，將轉染後的肝幹細胞經門靜脈注入肝臟。按期取肝臟標本，根據Y染色體標志染色及GFP，確定轉基因肝幹細胞在供肝中的定植、分布情況；檢測轉入肝幹細胞的基因在肝臟中的表達情況；移植排斥反應的發生情況。
2007.07-2007.12 補充實驗遺漏，整理實驗資料，統計處理實驗數據，撰寫論文。
預期研究結果
1.證明轉染DcR3基因的肝幹細胞能在供肝匯管區及部分血管內皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞中持續表達，同時誘導出長期的肝移植免疫耐受。
2.在國外學術期刊上發表論文2-3篇，在國內核心期刊發表論文6-8篇，並在國內學術會議交流。
(二）研究基礎與工作條件
1.工作基礎（與本項目相關的研究工作積累和已取得的研究工作成績）
2月底至3月初出結果。
2.工作條件（包括已具備的實驗條件，沿缺少的實驗條件和擬解決的途徑，包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的計劃與落實情況。）
刪去
3.申請人簡歷（包括申請者和項目組主要成員的學歷和研究工作簡歷，近期已發表與本項目有關的主要論著目錄和獲得學術獎勵情況及在本項目中承擔的任務。）
刪去
（三）經費申請說明（要求按照《國家自然科學基金經費管理辦法》認真填寫，購置5萬元以上固定資產及設備等，須逐項說明與項目研究的直接相關性及必要性。）
（四）其他附件清單（附件材料復印後隨紙質《申請書》一並上交）（隨紙質申請書一同報送的附件清單，如：具有中級技術職稱申請者的推薦信或在職研究生申請項目的導師推薦信等。）
『貳』 肝癌產生的分子機制是什麼
原發性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,HCC)是指肝細胞或肝內膽管細胞發生的癌，是惡性程度及轉移率很高的腫瘤之一。近年來，隨著分子生物學技術的不斷進步，對HCC發病機制的研究愈發深入。
1 抑癌基因與HCC
HCC的生成涉及許多基因的變化，基因變化的積累引起控制細胞生長和分化機制的紊亂，而生長分化間的平衡受控於兩類基因：癌基因和抑癌基因。抑癌基因參與細胞增殖和、凋亡和DNA復制等過程，其表達的失控導致HCC的發生和發展。
1.1 WWOX基因(WWdomain containing oxidorectase，WWOX) 位於染色16q23.3q24 ，其編碼蛋白具有兩個WW結構域，以及一個短鏈脫氫酶/還原酶結構(shortchain dehydrogenase/rectase domain，SRD)。它能夠與cJun、 TNF、p53、p73、AP2γ及 E2F1等相互作用，通過轉錄抑制及促進細胞凋亡來達到抑癌的目的，而其中促細胞凋亡的功能顯得尤為重要。WWOX的抑癌機制為：①將轉錄因子AP2γ隔離於細胞質之內並抑制其轉錄活性[1];②觸發p73重分布並抑制其轉錄活性，激活細胞凋亡[2];③上調P53並下調Bcl2 和BclXL，促進細胞凋亡[3]。
WWOX基因的缺失突變或移碼突變導致其不同結構域的部分或完全喪失，形成不同形式的WWOX轉錄產物。WWOX的多種錯義突變及單核苷酸多態性(SNP)在多種腫瘤細胞系被確定，黃麴黴素B1所致的HCC中可見位於16號染色體內脆弱性部位FRA16D的雜合性丟失。WWOX的表達增強能夠抑製成纖維細胞生長因子FGF2介導的細胞增殖，並增強cJun氨基端激酶抑制劑SP600129所誘導的細胞凋亡[4]。
1.2 Parkin基因 位於染色體脆性位點FRA6區域，此區域也是突變重排的熱點。Parkin屬於RBR蛋白家族，與泛素相關蛋白分解途徑有關。Parkin的抑癌機制為：①Parkin的缺失抑制細胞凋亡蛋白caspase的活化，並以卵泡抑素依賴性的方式使肝細胞抵抗凋亡，促進肝腫瘤的發生[5];②由於FRA6E 的普通脆弱性部位(FRA6E common fragile site)不穩定性導致的Parkin表達缺失，將引起細胞快速增殖及細胞對凋亡的敏感性的減弱[6]。
Parkin基因缺失導致肝細胞增殖及肉眼可見的HCC。微陣列分析顯示Parkin的缺失導致肝臟基因表達的改變[5]。Wang等[7]證實HCC組織中Parkin的表達比正常肝組織低，將Parkin基因轉染到Hep3B細胞中，可以增加其對凋亡的敏感性，且對其生長具有負性調節作用。因此推測Parkin的缺失將促進肝癌的發展。
1.3 RB基因 RB作為轉錄因子E2F/DP 家族抑制物，調節細胞增殖中的基因表達，它的失活將導致細胞周期的異常轉變。RB的抑癌機制為：①通過維持染色體的穩定性來抑制腫瘤的發生[8];②與轉錄因子E2F結合從而影響其轉錄活性，抑制細胞增殖[10]。
總的來說，RB的失活在腫瘤發生的早期起到促進細胞增殖的作用。然而，細胞培養模型顯示，RB的失活導致細胞適度的增殖，而RB缺陷則使DNA復制與細胞周期解偶聯，導致基因組的不穩定。以上機制尚不清楚，可能與RB的目標信號途徑有關。在小鼠的肝癌模型中，RB基因丟失並不會刺激細胞增殖，但卻使DNA的復制周期出錯，導致異常的染色體倍數。以DNA損傷劑二乙基亞硝胺作為腫瘤促發物製作老鼠肝癌模型，發現RB的喪失將大大增加腫瘤的易感性，這是由於對DNA損傷的不適當應答加速了基因組穩定性的喪失[8，9]。
1.4 第10染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因 (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten , PTEN) 位於染色體10q23.3，是細胞內磷脂醯肌醇三磷酸水平的負調節因子。PTEN的抑癌機制為：①抑制局部粘著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)和SH2包含蛋白(SH2containing protein, Shc)磷酸化及RAS介導的MAP激酶的活化，抑制細胞生長分化[11];②使 PIP3去磷酸化，抑制 PI3K/ PKB/ AKT 信號通路，阻止細胞生長及促進細胞凋亡[12]。
HCC與哺乳動物雷帕黴素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路的抑制有關。Sieghart等[13]發現，47%的HCC中PTEN的減少或缺失與mTOR通路中磷酸化蛋白的表達負相關。另外，PTEN的啟動子活性喪失造成其表達減少，但Wang等[14]證實PTEN的失活並不僅僅是因為突變或啟動子甲基化，可能還與其後續調節有關。PTEN表達的減少意味著HCC的進展及預後不良，這可能與VEGF呈負相關的表達有關[15]。
不飽和脂肪酸通過激活mTOR與核因子NFkappaB形成的信號復合物來抑制PTEN在肝癌細胞HepG2中的表達。表達下調的PTEN通過對細胞中脂肪酸的輸入，酯化及輸出作用誘發肝細胞脂肪變。由此證明，肝脂肪變是由於暴露於高水平的不飽和脂肪酸的肝細胞中PTEN表達的改變所介導的[16]。PTEN表達的下調及P53的過度表達參與了HCC的發病機制。它們與增殖細胞核抗原PCNA的高表達，HCC的去分化及HCC的早期階段有關[17]。非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)的患者可以逐漸進展為肝硬化甚至肝癌。在PTEN缺失型小鼠中，已觀察到能產生肝腫大及脂肪性肝炎，並逐漸發展為肝纖維化及肝癌，類似於人類NASH。據此認為，PTEN的缺失導致了這一系列的變化[18]。
2 癌基因與HCC
2.1 陷阱受體3 (decoy receptor 3, DcR3) DcR3是一種腫瘤壞死因子受體超家族的成員，在腫瘤組織中特異性表達。它與腫瘤細胞的凋亡有關，可能在腫瘤的發生及進展中起到關鍵的作用。DcR3致癌機制為：①抑制FasL及Lt 樣誘導蛋白(LTrelated incible ligand, LIGHT)介導的細胞凋亡[19];②DcR3不僅幫助腫瘤細胞逃避免疫監視，而且可以通過阻滯TNF樣細胞因子1A(TNFlike cytokine 1A, TL1A)的功能來誘導血管生成[20];③通過上調粘附分子及炎性趨化因子的表達來增強單核細胞對內皮細胞的粘附[21]。表達DcR3的HCC細胞其凋亡指數較對照組明顯降低，在腫瘤轉移20個月以內的HCC中檢出率為100%，且與血清AFP及門靜脈腫瘤栓塞的發生率正相關[22]。另外，它不僅作為陷阱受體中和免疫系統對腫瘤的攻擊，而且在炎症、先天免疫與腫瘤形成的聯系中起到關鍵作用。
2.2 垂體瘤轉化基因1(pituitary tumor transforming gene 1，PTTG1/Securin) PTTG1表達細胞周期調節蛋白Securin，它能夠抑制姐妹染色單體的分離，參與細胞轉化和腫瘤形成。PTTG1與DNA的修復及反式激活cmyc, bax 和 p53參與的不同的細胞信號通路有關。PTTG1的致癌機制為：①通過Securin與p53相互作用，阻礙p53與DNA的結合並抑制其轉錄活性[22];②抑制p53的功能，促進細胞凋亡[23];③刺激細胞過度表達βFGF、VEGF和IL8，促進細胞生長和血管形成[24]。p53在應激條件下對基因表達的調節起到至關重要的作用。Securin是p53轉錄活性的負調節因子。PTTG1/Securin的喪失將導致p53蛋白的半衰期的改變。另外，PTTG1介導的FGF-2的上調與瘤內的微血管密度有關。研究發現，PTTG1在HCC中表達明顯增加，可作為術後生存率的預測指標[25]。
3 生長因子與HCC
3.1 肝細胞生長因子( hepatocyte growth factor,HGF) HGF通過刺激細胞的運動性及血管生成效應來促進腫瘤的生長，還能通過轉錄因子Egr1促進肝細胞癌中5α還原酶1的轉錄來調節類固醇的代謝，可能成為女性肝癌發生高風險因素[26]。
3.2 轉化生長因子(transfoming growth factor,TGF) TGF在調節細胞生長與分化，血管形成，細胞外基質形成，免疫抑制及腫瘤發生中起到重要作用。肝癌細胞中TGFβ表達的異常與HCC的分化程度及HBV復制有關，但與腫瘤的大小及數量無關[27]。TGFβ能夠上調Rac依賴性NADPH氧化酶Nox4，通過氧化應激方式誘導肝細胞凋亡。敲除Nox4基因後，會引起TGFβ誘導的凋亡受損，引起HCC凋亡抵抗[28]。
3.3 血小板源性生長因子(plateletderived growth factor，PDGF) TGFβ能夠通過上調血小板源性生長因子A(PDGFA)及PDGF受體來誘導PDGF的分泌。PDGF在腫瘤的形成過程中為腫瘤提供粘附及轉移的性質並刺激其增殖[29]。
4 病毒相關基因與HCC
HBV及HCV被公認為是HCC的重要發病因素之一，其導致肝細胞轉化的機制仍然未明，至今仍未發現與HBV及HCV特異性相關的人類基因的存在。目前認為肝細胞損傷後的復制修復導致了與肝癌發生相關的隨機突變的積累。
4.1 HBV HBx基因與肝細胞癌的發生發展密切相關。HBx是一種反式激活因子，能夠通過蛋白間的相互作用間接激活多種細胞與病毒的啟動子。HBx的構象多變性也許可以解釋其功能的復雜性，即它能夠與一系列信號蛋白，轉錄調節因子及核酸發生作用。在具有惡性表型的HCC中常可見細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的過度表達，而HBx通過NFκB2(p52)/BcL3復合物的介導上調Cyclin D1的表達[30]。
許多與HBx表達有關的細胞信號轉導活動及其激發的病毒復制與酪氨酸激酶Pyk2和Src參與的鈣離子信號通路有關。HBx可以激活FAK及Pyk2/FAK激酶家族的其它成員。而FAK的激活對於HBx的功能起到非常重要的作用。FAK的抑制將阻礙HBx對Src及下游信號轉導的激活，以及對NFκB和AP1依賴性轉錄的激活，並阻礙HBV DNA的復制。HBx激活的FAK可能成為HBV相關性肝癌的潛在輔助因子[31]。
4.2 HCV HCV感染導致肝癌的發病機制仍未完全明了。病毒蛋白與宿主細胞間的相互作用可能在HCC的發生中起到重要的作用，並且獨立於肝硬化所致的肝癌。
4.2.1 HCV Core 核心蛋白Core能夠干擾和轉變細胞生長周期的各個階段，導致有絲分裂的異常。Core能夠與雙鏈RNA依賴蛋白激酶PKR相互作用，而PKR參與細胞生長的許多過程，如凋亡。 PKR能夠被IFN激活，並磷酸化真核翻譯起始因子2A(eukaryotic initiation factor2A，eIF2A)來抑制細胞蛋白的合成，從而抑制細胞生長。Core誘導PKR的Thr446位磷酸化，這將改變PKR對各種底物的活性，包括阻止細胞凋亡。
細胞生長周期各個不同階段的檢查點(checkpoint)的破壞是腫瘤形成的一個重要方面。Core能通過加強P53與其DNA結合位點的親和力或增強其轉錄激活的活性而並不增加P53的表達來增強P53的功能[32]。雖然在細胞核中找到少量的Core，但其主要分布在細胞質內，而P53則定位於細胞核內。因此，P53功能的加強並不能完全由以上機制來解釋。
雖然研究證實了Core的以上功能，但具體機制仍然未明。事實上，信號通路的復雜性及肝細胞癌變過程的多階段性顯示了肝癌的發生是一個基因上調與下調的序貫組合。這些基因受到影響並不意味著它們都參與了癌變的發生。但要強調的是，Core確實能夠改變細胞信號傳導途徑。
4.2.2 HCV NS5A 非結構基因NS5A能夠通過PKR通路來激活NFkappaB因子導致炎症，還能夠直接抑制PKR通路。NS5A中的重要序列ISDR能夠與PKR結合，阻止其形成二聚物，導致其功能的喪失，並阻止eIF2的磷酸化。然而有研究證實，在表達NS5A的細胞系中，NS5A對PKR似乎並沒有明顯的影響。由於PKR遍布於細胞質內，而HCV的其它蛋白的共同表達使得NS5A定位於細胞器質膜表面，從而減少N5SA與PKR結合的可能性。另外，NS5A還能與P53的結合導致p21的下調並促使細胞生長。
『叄』 哪位大佬有AIMiner(智能挖礦軟體) 安裝包
軟體介紹
IMiner智能挖礦是由比特威風（BITVF）推出的一款一鍵式挖礦優化工具。它能夠支持挖以太坊，以太經典，零幣，紅燒肉，門羅幣等多種幣種，也支持同時雙挖幣種DCR和SC等，支持在Nvidia和AMD顯卡。提高了N卡和A卡的挖礦算力，支持礦機監控。
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功能介紹
1、支持雙挖幣種
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3、支持礦機監控
4、支持Windows
5、提高挖礦算力
6、一鍵式挖礦
『肆』 不以規矩，不成方圓
《不以規矩，不能成方圓》出自《孟子》的《離婁章句上》。 孟子要求當政者實施仁政的鼓吹與吶喊。具體落實到兩個方 面：一是「法先王」；二是選賢才。所謂「不以規矩，不能成方圓」的說法成為了人們在生活中常用的格言警句。
詳見：http://ke..com/link?url=_-0KdPk7j_4rQPo1__wMCmMomxc5HHC82g5ZyLG9J-eYPVAPeJwmDcr3-SHedqroLRzcG-VAu
『伍』 求鄧紫棋新歌 【另一個童話 ] 【倒數】 【錯過不錯] 謝謝！
過的不錯
『陸』 3dCR燈罩怎麼調
2、調節燈罩材質：（1）選擇一個材質球並調整為VR材質，在其漫射顏色通道中加入一張類似於右圖圖樣的「貼圖」；（2）同時在折射貼圖通道中也加入以上那張同樣的貼圖，改其折射率為1.1，折射光澤度為0.1，折射細分值為20左右，勾選使用插值、影響陰影及影響Alpha。
3、也可以給燈光的稍微加一點暖色
『柒』 化學方程式如何配平吶
簡單得很就用最小公倍數法
『捌』 什麼是POW和POS，二者區別聯系
POW：全稱Proof of Work，工作量證明。
POS：全稱Proof of Stake，權益證明。
區別是：
1、POW機制：工作量證明機制即對於工作量的證明，是生成要加入到區塊鏈中的一筆新的交易信息(即新區塊)時必須滿足的要求。在基於工作量證明機制構建的區塊鏈網路中，節點通過計算隨機哈希散列的數值解爭奪記賬權，求得正確的數值解以生成區塊的能力是節點算力的具體表現。
2、POS機制：權益證明要求證明人提供一定數量加密貨幣的所有權即可。權益證明機制的運作方式是，當創造一個新區塊時，礦工需要創建一個「幣權」交易，交易會按照預先設定的比例把一些幣發送給礦工本身。權益證明機制根據每個節點擁有代幣的比例和時間，依據演算法等比例地降低節點的挖礦難度，從而加快了尋找隨機數的速度。
(8)DCR3礦機擴展閱讀：
比特幣（BitCoin）的概念最初由中本聰在2009年提出，根據中本聰的思路設計發布的開源軟體以及建構其上的P2P網路。比特幣是一種P2P形式的數字貨幣。點對點的傳輸意味著一個去中心化的支付系統。
與大多數貨幣不同，比特幣不依靠特定貨幣機構發行，它依據特定演算法，通過大量的計算產生，比特幣經濟使用整個P2P網路中眾多節點構成的分布式資料庫來確認並記錄所有的交易行為，並使用密碼學的設計來確保貨幣流通各個環節安全性。P2P的去中心化特性與演算法本身可以確保無法通過大量製造比特幣來人為操控幣值。
『玖』 計算電感值
2*PAI*F*L只是感抗
阻抗你要考慮 電阻 電感 電容對交流的阻礙作用
參考資料：http://bbs.big-bit.com/forum.php?mod=viewthread&tid=450257
請採納答案！