當前位置:首頁 » 幣種行情 » trx蛋白標簽

trx蛋白標簽

發布時間: 2024-06-19 04:48:22

⑴ TRX標簽蛋白怎麼純化

一般這個載體中都會有His 標簽,直接用鎳柱純化即可

⑵ pet32a切除標簽

這個我剛好做過,用腸激酶切除~~用Ni-NTA鎳柱純化,你給我個郵箱,方法我發給你

⑶ 蛋白質融合標簽

蛋白標簽(Protein tag)技術是指利用基因克隆手段,將具有特定功能的多肽,蛋白質結構域,甚至完整蛋白質與目標蛋白融合在一起,以實現目標蛋白的表達純化,檢測和示蹤等應用的技術。蛋白標簽融合已經成為蛋白質研究中最常用的技術之一,下面我就為大家盤一盤這些常用標簽的特點及應用。

蛋白標簽根據其功能,大致可以分為檢測標簽、表達純化標簽和示蹤標簽三類。

蛋白質的檢測方法包括質譜、酶活檢測、免疫分析等,其中應用最為廣泛的是免疫分析,常用的方法有:WB(Western Blot)、ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)、IP(Immunoprecipitation)等。免疫分析需要將目標蛋白作為抗原,注射動物,然後從免疫血清中分離抗體,根據抗原-抗體間的免疫反應進行特異性檢測。這種方法最大的缺陷就是每更換一個目標蛋白就要制備一個對應的抗體,操作繁瑣,成本昂貴。融合標簽的使用,使蛋白質免疫分析走向通用化和便利化。我們將特定的標簽與目標蛋白融合後,兩者是共同表達的,通過檢測融合標簽,可以得到目標蛋白的表達情況。經過長期的研究,目前已經開發出一些比較成熟的檢測標簽,下面就挑幾個來介紹一下:

1) HA

HA標簽,屬於小標簽,共9個氨基酸,標簽序列YPYDVPDYA,源於流感病毒的紅細胞凝集素表面抗原決定簇,對目標蛋白的空間結構影響小, 可融合到N端或者C端,可購買商業化的Anti-HA抗體檢測。HA標簽常用於蛋白質印跡,免疫熒光和免疫沉澱實驗,偶爾用於ELISA和ChIP分析。

2) His

His標簽,也是小標簽,多指6個組氨酸多肽,該標簽對目標蛋白的空間結構影響極小, 可融合到N端或者C端,一般無需切除也不會對目標蛋白功能產生影響,可購買商業化的Anti-His抗體檢測。His標簽常用於蛋白質印跡實驗。

3) c-Myc

Myc標簽,包含人類原癌基因Myc的10個氨基酸區段,序列為EQKLISEEDL,可融合到目標蛋白N端或者C端。由於可獲得高特異性抗Myc單克隆抗體,因此在Western印跡,免疫熒光和免疫沉澱實驗中被廣泛使用,但是很少用於蛋白質純化。目前,市場上已有很多可供選擇的商業化c-Myc抗體。

4) Flag, 3×Flag

FLAG標簽,是目標蛋白中一種比較流行的短肽標簽,序列為DYKDDDDK,可以與蛋白質的C端或N端融合。由於其包含腸激酶的識別位點(DDDDK),可方便去除,因此比較適合融合在目標蛋白N端。Flag標簽與同類標簽相比,更具親水性,因此通常不會變性或使與其連接的蛋白質失活,常用於真核表達系統中目標蛋白的檢測。目前已經開發出性能更好的3×Flag 標簽,共22個氨基酸,分子量2.7KDa。3×Flag標簽序列不是唯一的,有文獻直接用3個Flag的串聯重復,這不利於標簽的去除,常用的序列為序列為DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK。3×Flag可免疫原性和與抗體的親和性得到極大增強,適用於真核生物低水平表達的蛋白的檢測和純化。目前,市場上已有很多可供選擇的商業化Flag及 3×Flag抗體。

5) S

S標簽,是一段來源於胰腺核糖核酸酶 A(RNase A)N 末端的短肽,氨基酸序列為KETAAAKFERQHMDS。 通常將 S-tag 構建到目標蛋白的 N 末端或 C 末端上,可以使用商業化的 S-tag 抗體進行免疫檢測。此外,S-tag與S-蛋白質(同樣來自於RNase A)之間有強烈相互作用,因此S-tag可用於蛋白質純化,但由於洗脫條件較苛刻,為了獲得有功能的蛋白質推薦用蛋白酶切割標簽,然後洗脫目標蛋白。

6) T7

T7標簽,一種源自T7噬菌體衣殼蛋白的表位標簽,序列為MASMTGGQQMG,可融合到目標蛋白質的N或C末端,可購買商業化的Anti-T7抗體檢測。T7標簽常用於蛋白質印跡實驗。

7) V5

V5標簽,是猿猴病毒5(SV5)副粘病毒P和V蛋白上存在的小表位(Pk)短肽,序列為RNA聚合酶α亞基的95-108位氨基酸殘基GKPIPNPLLGLDST,可被融合到目標蛋白的N或C末端。在文獻報道中,大多將V5融合到目標蛋白C端,常用於哺乳動物和昆蟲細胞表達系統蛋白質印跡,免疫熒光和免疫沉澱檢測。

蛋白質純化的方法有很多,離子交換、疏水層析、分子篩和親和層析,其中純化效果最好的無疑是親和層析,它利用基質與蛋白標簽間的特異性結合,以極高的得率和純度獲得目標蛋白。下面就挑幾個常用的純化標簽來介紹一下。

1) His

His標簽,大多是指六個組氨酸組成的融合標簽,即His6,可融合在目的蛋白的C末端或N末端。His標簽在蛋白質純化領域可謂是「最靚的仔」,1987年,Hochuli等首次提出利用組氨酸標簽純化蛋白質,至今His標簽在蛋白質純化領域仍有最廣泛的應用。組氨酸殘基側鏈與固定的鎳離子有強烈的吸引力,可用於固定化金屬螯合層析(IMAC)。標簽的分子量小,只有約0.84KD,一般不影響目標蛋白的功能,此外His標簽也可用於免疫檢測,而融合His標簽的蛋白免疫原性較低,可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫並制備抗體。

2) GST

GST(谷胱甘肽巰基轉移酶)標簽,是蛋白質純化最常用的標簽之一,GST是大標簽,它是一個完整的蛋白質,分子量約26KD。GST一方面具有高度可溶性,能夠增加目標蛋白的可溶性;另一方面它可以在大腸桿菌中大量表達,提高目標蛋白的表達量。因此被廣泛應用於各種融合蛋白的表達,可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達。GST標簽融合蛋白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠的親和樹脂進行純化,用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫,可得到高濃度、高純度融合蛋白。不過由於GST標簽較大,通常需要將該標簽切除,因此GST一般融合在靶標的N端。對於目標蛋白為活性酶的情況,如果經過活性驗證確認GST對酶的活性沒有影響,也可以保留標簽。目前,也有很多商業化的GST抗體可用於對目的蛋白進行用特異性檢測。

3) MBP

MBP(麥芽糖結合蛋白)標簽,是蛋白質純化最常用的標簽之一,也是大標簽,分子量大小在40kDa以上,由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加目標蛋白在細菌中的溶解性,尤其是真核蛋白,也可以增加融合蛋白表達量。MBP可以和交聯澱粉親和樹脂結合,結合的融合蛋白可用10-20mM麥芽糖在溫和條件下洗脫,得到高純度、高濃度目標蛋白。MBP的特點與使用方法與GST十分相似,也有專門的商品化抗體進行檢測。需要注意的是,MBP序列有兩種形式,一種N端含有信號肽,適用於毒性蛋白的表達純化,一般融合在N端;一種不含信號肽序列,可融合在N端或C端,多融合在N端。

4) CBD

CBD標簽,一般是指來源於枯草桿菌的幾丁質結合結構域,分子量約5kDa,該標簽由NEB公司推出,結合其IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)系統,用於(毒性)目標蛋白的表達與純化。在IMPACT系統中,CBD和一個來源於酵母的intein蛋白質組成一個雙效的融合標簽。Intein是一個蛋白質剪接元件,類似於基因組中的內含子,intein在較低的溫度和還原條件下發生自身介導的N端裂解,可以釋放出與之相連的目的蛋白。也就是說融合表達產物在掛上親和層析柱後只需要在低溫(4℃)條件下用含DTT,或者巰基乙醇,或者半胱氨酸的溶液洗脫,即可將目的蛋白洗脫,而將融合標簽留在純化柱上,而還原劑的小分子可以非常簡單的去除。後來NEB推出了IMPACT-CN系統(即融合標簽可以選擇在目的蛋白的C端或者N端)和更加靈活便利的IMPACT—TWIN系統,感興趣的可以自己去了解下。
(我使用過該系統,但效果並不像宣傳的那麼理想,原因有兩個:1)因為要使用DTT作為切割劑,不適合含有內部二硫鍵蛋白質的純化 2)融合基因在體內體外均存在較大的自剪切風險,在純化毒性較大的蛋白質時,很難得到目標蛋白。)

5) Strep-tag

Strep標簽,一般指Strep-tag II,是長度8個氨基酸的短肽,序列為WSHPQFEK,可以融合在目標蛋白N端或C端。Strep標簽融合蛋白與鏈黴菌抗生物素蛋白柱上的基質特異性結合,D-生物素或其衍生物可作為洗脫劑,從而實現融合蛋白的特異性純化。由於,抗體柱十分昂貴,Strep標簽在蛋白純化中並不常用。

6) Halo-Tag

Halo標簽,是一種細菌脫鹵素酶的遺傳修飾衍生物,可與多種合成的Halo-Tag配基有效地共價結合,分子量為33KDa,可融合在重組蛋白的N端或C 端,並在原核和真核系統中表達。

7) SNAP-tag

SNAP-標簽,是一種人的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶的突變體,長度為182個氨基酸,分子量約19 kDa,可與任何目標蛋白質融合,並進一步用合適的配體(例如熒光染料)進行特異性和共價標記。將純化的或未純化的SNAP-Tag融合蛋白與表面固定了苯甲基鳥嘌呤的基質混合,蛋白即可特異與底物作用,形成共價鍵,融合蛋白間接被固定在了基質表面上,可以達到更方便快捷地研究蛋白功能或純化蛋白的目的。SNAP-Tag是新一代的蛋白標簽技術,不僅專一性極高而且穩定,最大的優點是適用於多種環境下的蛋白質檢測與純化,如活細胞內、溶液中、或固態相(如SDS-PAGE gels)等。

8) SUMO

SUMO標簽,是一種小分子泛素樣修飾蛋白(Small ubiquitin-like modifier),在一級結構上與泛素只有18%的同源性,但兩者的三級結構及其生物學功能卻十分相似。研究發現,SUMO可以作為融合標簽,不但可以提高融合蛋白的表達量,且具有抗蛋白酶水解以及促進目標蛋白正確折疊,提高重組蛋白可溶性等功能。此外,使用SUMO蛋白水解酶,能識別完整的SUMO標簽,並高效的把SUMO從融合蛋白上切割下來。該標簽主要用於改善目標蛋白的表達,並非常用的純化標簽,要用於純化可採用雙標簽。

9) NusA、TrxA、DsbA

NusA標簽是一種反轉錄終止因子,能增加融合蛋白的溶解度和表達;TrxA標簽是硫氧還蛋白,幾乎存在於所有生物中,它即可能會增加融合蛋白的溶解度,方便地純化細菌粗周質提取物,也有助於外源基因形成二硫鍵;DsbA標簽是蛋白質二硫鍵異構酶,能夠增加目標蛋白溶解度,有助於形成二硫鍵。

這三種標簽,主要用於改善目標蛋白的表達,本身不用於純化,必須與另一個親和標簽聯用方可實現蛋白質純化。而且這三種標簽均具有細胞周質定位作用,因此一般融合在目標蛋白N端。這三個都屬於大標簽,可能會影響融合蛋白的性質,一般來說純化後需要去除。

示蹤標簽主要是指利用標簽本身的熒光或者催化底物發射熒光或者可見光,來檢測目標蛋白在生物體內定位、轉移、互作的情況。示蹤標簽一般分子量較大,需要在標簽與目標蛋白之間加Linker序列,避免兩個蛋白相互影響各自的功能。示蹤標簽可與檢測標簽聯用,用於目標蛋白的檢測分析,也可與純化標簽聯用用於後繼純化。

1) GFP、EGFP、YFP

GFP(Green fluorescent protein,綠色熒光蛋白)標簽含有 238 個氨基酸,分子量約為 26.9 KDa,在維多利亞多管發光水母中發現的,在紫外線的照射下會發出綠色的熒光的蛋白,與靶蛋白融合後不會顯著地影響天然蛋白質的組裝和功能。EGFP 標簽是增強型綠色熒光蛋白,與 GFP 相比,具有更高的折疊效率(由於正確折疊的蛋白質比例更高而增加的熒光),熒光強度更強、熒光性質更穩定。YFP(Yellow Fluorescent Protein ,YFP)標簽,可以看做綠色熒光蛋白的一種突變體,其熒光向紅色光譜偏移。這些標簽與目標蛋白融合後,可以通過激光共聚焦顯微鏡,觀察融合蛋白在生物體內的情況,常用於亞細胞定位、熒光共定位分析、在體熒光成像等實驗。示蹤標簽可以加在目標蛋白的N端或C端,這個要視具體的情況而定,比如細胞定位示蹤,如果定位序列位於目標蛋白N端,標簽就要加在C端;如果定位序列位於C端,標簽就要加在N;如果定位序列位於中間,可以加在N端或C端。

2) 螢光素酶

螢光素酶(Luciferase,Luc)常作為「報告蛋白」被用於分子生物學研究中,常見的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶和Guassia熒光素酶,他們可以催化熒光素底物發射熒光,作為示蹤標簽常用於活體成像、葯物分析等領域。攜帶熒光素酶標簽(Luc)的質粒轉染入細胞後,導入研究動物如大小鼠體內,之後注入熒光素底物,通過生物發光成像技術(BLI)來檢測光強度變化,從而實時監測疾病發展狀態或葯物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響,根據生物發光強度的變化來指示能量或生命體征。

3) Gus

Gus標簽,是細菌β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase),能催化許多β-葡萄糖苷酯類物質的水解。該酶可將X-Gluc水解生成藍色物質,初始產物並不帶顏色,為無色的吲哚衍生物,後經氧化二聚作用形成5,5』-二溴-4,4』-二氯靛藍染料,此靛藍染料使具有GUS活性的部位或位點呈現藍色,可用肉眼或在顯微鏡下觀察到。因為絕大多數植物細胞內不存在內源的GUS活性,因此gus基因廣泛用作轉基因植物的報告基因。用作融合標簽時,gus標簽可放在目標蛋白的N端或C端,所產生的融合蛋白一般仍具有GUS活性,這對研究外源基因表達的具體細胞部位提供了方便條件。

當然不是,幾乎任何標簽都可以作為檢測標簽。不過上面這些標簽應用比較廣泛,檢測靈敏度較高,對應抗體、試劑等也比較成熟,是最為常用的檢測標簽,在加檢測標簽時,可以作為首選。

當然也不是,檢測標簽、純化標簽、示蹤標簽,在功能上沒有絕對的界限,所有的檢測標簽也可以用於純化,只不過需要先制備對應的抗體固定到純化基質上,比如S標簽需要S蛋白固定到純化樹脂上,這就需要購買專門的純化柱料,十分昂貴。當然也可以採取通用的做法,比如通過protein A吸附抗體,再利用抗體吸附融合的目標蛋白,但是這樣做純化效率可能不太高,吸附能力也有限,而且成本較高(protein A柱料的價格是Ni-NTA柱料的5-10倍),雖然這種方法可以得到極高的純度,但並沒有被普遍採用。

標簽選好了,那到底是該加在N端還是C端呢?在較多的報道中,標簽一般加在目標蛋白的C端,因為蛋白質折疊是從N端開始的,加在N端有被目標蛋白包埋的風險。但是,目前沒有統一的標准,要具體情況具體分析,最好參閱相關文獻。

一般檢測標簽都是小標簽,對目標蛋白的功能與結構影響不大,N端C端皆可。需要注意的是採用雙標簽的情況,如果是兩個小標簽,那就一邊一個,一般不建議串聯兩個不同的標簽,比如一個3×Flag檢測標簽,一個His純化標簽,那就應該把3×Flag放在N端,His放在C端,因為純化之後大概率需要切除3×Flag,如果兩者交換位置就無法實現這樣的目的。

His標簽是應用最廣泛的標簽,既可以用於純化也可以用於檢測,而且大多數情況不需要切除,加在N端存在提前終止翻譯和無法終止翻譯的可能,產生的副產物不利於分離純化;加C端時存在次級翻譯起始的可能,產生的副產物也不利於分離純化,雙端His有利於目標蛋白的准確檢測與純化,但可能影響酶的活性。

純化標簽分子量較大,多數情況下要被切除,因此一般放在目標蛋白N端,檢測標簽放在C端,如過必需將大的純化標簽放在C端,檢測標簽可放在目標蛋白N端或者融合蛋白C端。但檢測標簽不能放在目標蛋白與純化標簽之間。

對於GFP標簽,大多用於目標蛋白的細胞定位,應此標簽的位置就由定位序列位置決定,定位序列在C端,GFP就應該放在N端,檢測標簽應該放在GFP的N端;反之,GFP應放在C端,檢測標簽放在GFP的C端。

當融合標簽對目標蛋白的功能與結構沒有影響時,不需要切除融合標簽,這不是只針對小標簽,大標簽如GST、MBP等也是如此,NEB公司純化的一些核酸工具酶就是融合了MBP標簽的,我曾融合表達了MBP-APOBEC3A,MBP並不影響APOBEC3A的C→T活性,基因編輯技術中的AE和CE點編輯系統,就是基於Cas蛋白與APOBEC蛋白各自的功能實現的。兩者分子大小相差極大但功能互不影響,就是因為各自的功能結構域折疊比較穩定,且無蛋白質間相互作用。如果融合標簽與目標蛋白也滿足這種關系,基本是不用去除標簽的,不過這種影響是不可預料的,可以參考相關文獻或者做預實驗確定。
常用的去除蛋白標簽的蛋白酶,及其識別序列如下表。

[1] Protein tag[維基網路], https://en.wikipedia.org/wiki/Protein_tag
[2] Kimple M E, Brill A L, Pasker R L. Overview of affinity tags for protein purification[J]. Current protocols in protein science, 2013, 73(1): 9.9. 1-9.9. 23.
[3] Marintcheva, B. Viral Tools for Protein Expression and Purification. Harnessing the Power of Viruses, 2018, 103–131.
[4] Terpe, K. Overview of tag protein fusions: From molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, 60: 523–33.
[5] Nilsson, J. et al. (1997) Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of recombinant proteins. Protein Expr. Purif., 1997, 11: 1–16.
[6] Malhotra A. Tagging for protein expression[M]//Methods in enzymology. Academic Press, 2009, 463: 239-258.

⑷ trx是什麼意思

trx懸掛訓練;硫氧化還原蛋白;硫氧還蛋白;蛋白;收發信機。

Trx has various biological functions in keeping stable redox status of cells.

硫氧還蛋白具有多種生物學功能,對維持體內穩定的氧化還原狀態具有重要的作用。

Construction of recombinant adenovirus vector with TRX gene by Tet-Off inction.

Tet-Off誘導的硫氧還蛋白基因重組腺病毒載體的構建。

These studies have shown that: TRX can suppress tumor cell apoptosis.

研究表明:TRX可以抑制腫瘤細胞凋亡。

Trx plays crucial roles in regulating cell growth, apoptosis and gene transcription.

Trx具有調節細胞生長、抑制凋亡、調節基因轉錄等功能。

CONCLUSION: TRX protein plays an important role in the defense response of myocardium against oxidative stress.

結論:TRX蛋白在心肌的氧化應激防禦反應中起重要作用。

⑸ 重組蛋白的組氨酸標簽 怎麼去掉

6xHis標簽可用一些酶,譬如TAGZyme去除

⑹ pet-32a空載體是可溶性表達嗎

該空載體緊緊會表達一段Trx標簽蛋白,加上his標簽,約20kd左右,是高度可溶的。

⑺ 帶有trx標簽會不會影響蛋白的抗原性

有可能的
trx標簽是比較大的融合標簽,有20多KDa
非常有可能改變蛋白的抗原決定簇
一般為了不影響蛋白的功能,會在trx標簽和目標蛋白之間加一個酶切位點,比如腸激酶的位點DDDDK,把trx標簽去除掉

熱點內容
btmwin系統顯卡挖礦 發布:2024-07-19 10:54:53 瀏覽:170
區塊鏈彭博社 發布:2024-07-19 10:53:20 瀏覽:30
去塘廈新莞人服務中心 發布:2024-07-19 10:49:27 瀏覽:20
廣電運通數字貨幣的超級龍頭 發布:2024-07-19 10:48:09 瀏覽:864
數字貨幣的二級市場 發布:2024-07-19 10:45:01 瀏覽:158
gateio比特幣 發布:2024-07-19 10:28:56 瀏覽:992
宇宙是元胞自動機 發布:2024-07-19 10:19:20 瀏覽:499
農產品溯源區塊鏈實例 發布:2024-07-19 10:13:09 瀏覽:911
國外比特幣挖礦託管 發布:2024-07-19 10:12:15 瀏覽:235
hp800g1usdt怎麼樣 發布:2024-07-19 09:46:43 瀏覽:528