ethpia
㈠ 暗黑破壞神怎麼玩
有些bug可以利用起來，我們把它們作為技巧使用；有些bug則需要盡量避免。
1. bug mf
這個就不用多說了吧。簡單說就是，關底的五大boss有兩個TC，角色完成任務的時候殺掉該boss是任務殺，掉落物品最低亮金品質，並且不會掉落消耗品。bug mf就是通過建立bug游戲使得沒有完成該任務的角色可以無法完成該任務並反復享受任務殺，掉率較高。詳見——bug mf詳細解說
2. 無形防具升級bug
1.10的bug，1.11已經得到修正。eth的暗金防具使用升級公式升級之後，原有的eth物品50%防禦加成丟失。所以大家的無形蟲殼，無形wmj，無形ire之類的不要再升級了。
3.聚氣bug
1.10bug，1.11已經修正。從1.10版本開始，人物的各個技能之間有了加成。加成只有實際投入的技能點才能提供，裝備所帶的技能無效。但是，聚氣bug除外。當裝備了某個帶有聚氣的裝備，並且不加該技能，也不要從裝備上獲得該技能，自身的技能就可以獲得該聚氣技能提供的加成。典型的例子就是著名的bug鞋，33級骨牢聚氣使得骨系傷害力大大提高。還有腐肉之風戒指，21級的猛毒花藤可以加成狂犬病，便有了暴力毒狼的練法。
4.str/dex bug
str=力量，dex=敏捷。一般以力量bug使用較多。玩家不滿足該物品需求的力量 比如wmd需求156, 如果這時候玩家使用一件加力量的裝備滿足需求 比如用一個+20力量的戒指 在拿上wmd以後再取下戒指, 理論上是無法繼續用wmd的 ， 但實際上卻有可能用的了，因為wmd上加的30力量正好滿足了自己的要求,這就是所謂的STR BUG.
資料館BB補充：str bug可以在pet上使用，但使用str bug後，該裝備顯示為正常使用狀態，不過其防禦,抗性等皆會失效，表現為傭兵掛得特快。
慎用。小心被該bug暴屍。
5.ed/max(min) bug
ed/max jew鑲在防具上，ed只對最終最小傷害起作用，max對最終最大傷害起作用
ed/min jew鑲在防具上，ed只對最終最大傷害起作用，min對最終最小傷害起作用
一件防具上ed/max JEW出了bug,不影響另一件防具上的ed jew
防具本身上的ED不受影響(即只有ED/MAX OR MIN JEW部分的ED被去掉而已).
RARE JEW,同時具有ED MIN MAX的.ED部分完全無效,起作用的僅僅是MIN MAX部分
簡單來說，ed(增強傷害)屬性和max/min(最大傷害/最小傷害)屬性同時存在在一顆珠子上，該珠子就不要再往防具上鑲了。
6.葯水bug
毒抗太低？去阿卡拉那裡灌上10瓶黑瓶看看。毒抗變成85了吧？喝上幾瓶解毒水，可以在短時間內提高10的PR上限。類似的還有溶解瓶，可以提高cr。
7.charge bug
charge=沖鋒，pal的常用技能。進行連續沖鋒時有時會停在原地動不了，原因可能是連續charge造成法力不夠，或者charge沒有停下來的時候發動其他攻擊。可以按w切換武器解決。
還有一種情況是charge完之後無法再用charge，原因可能是——charge過程中遭受攻擊造成強制格擋；charge過程中被攻擊死亡；charge過程中pet死亡；charge過程中聖盾時間到。只能重新進游戲解決。
8.安亞bug
角色在pvp被殺後救安亞所得30抗性消失，只能靠重新進游戲解決。
9.sum bug
有大批召喚物的情況下tp，召喚物與自身重合，遠程攻擊不會對自己造成傷害。最實惠的當屬nec和dru了。
10.ama充能一擊bug
此bug單機無效。使用一定技巧，ama的充能一擊可以成為遠程攻擊，威力同近身相同。熟練應用此bug可以在進入世界之石大殿原地不動15秒k死巴爾……
11.回城bug
身上帶上一本回城/辨識書，然後把盒子放在箱子里，把書放在盒子里，存儲離開游戲。下次進入游戲的時候可以在身上沒有書的情況下回城/辨識，消耗的是盒子里的書。但是如果你打開了盒子bug就消失了。
12.set bug
裝備一套綠色裝備會獲得該套裝的獎勵加成。此時沖到怪堆里掛掉並復活，套裝獎勵仍然存在。
13.ww bug
D2常見bug(申請加個精)
ww=旋風，野蠻人的技能。
要形成ww BUG，必須
一、LOCK 對方NAME不鬆手；
二、和對方有一定距離，這也是WW BUG得操作過程。
在LocK期間，一定時間後（當你聽不到WW的呼呼聲），這時，你的WW會和CHARGE一樣造成BUG，也就是你得真實坐標不是你和對手在地圖上所看到的位置，往往看起來是WW離你很遠地轉過來，但下1秒對方已經掛了，因為WW其實已經到了對手身邊，而對手渾然不覺而已（你自己也不大知道 --#）
ww bug的優點是LOCK可以跟蹤對手（此時WW可以非直線性進攻），只消耗1次WW發動所需MANA。缺點是要有一定的啟動距離，並且有可能被障礙物打斷。
14.nec不死bug
nec穿tgo一套，副手同樣裝備套裝盾。出去沖到怪堆里，連續按w換手直到被殺死。如果運氣好，bug成功，在死的地方會站起一個吸血鬼。這時按esc復活，不要去撿屍體，就成不死之身了。還可以穿其它裝備。
不過這個bug很難成功。大家不要用這個bug去做壞事啊，被封了不要找我。
15.雙光環bug pet
就是雙夢或雙飛龍，1.10的BUG，1.11已經修正
16.城內pk bug（這個比較無恥，大家還是不要學了）
在城內點敵對，站在城鎮門口在城外對方身邊召喚某召喚生物，比如石魔，女武神，熊，影子等等，可以單方面虐待對方。
還有就是asn的城內殺人bug，把自己在某地方卡住，然後右鍵技能選擇影子大師，點對方的名字，這時應該是過去交易的，但如果asn被卡住過不去，影子就會追殺對方。
17.eth打孔bug（這個是1.11的新增bug）
沒有附加屬性的……0ed、0nj的eth普通防具（超強的防具無法用公式打孔）採用公式打孔後，防禦力會額外增加50%，而天生的最高ED才15％。
18.1.10nec的某bug(arnold789補充)
就是骨矛和骨魂在射程盡頭外形會消失，但傷害實際存在
19.ama的三躲bug(資料館BB補充)
當ama學會三躲中任意一個後，在使用不可中斷的技能(例:炮轟/擊退)時一旦三躲被發動，則該不可中斷的技能會失效，表現為繼續攻擊但敵人不掉血。
20.野蠻人不死bug
裝備火焰號叫這把劍獲得地獄之火技能，先放在左鍵施展，再放在右鍵施展，然後在施展地獄火的時候跳躍，將會變為不死（不能移動）。
資料館BB補充，冰霜之風這把劍可以提供極地風暴技能，同樣有這個bug。ww也可以。
21.不死的跳跳蟲
在act2，act4和act5均有出現的跳跳蟲(沙漠跳躍者等)有時會出現打不死的現象。現在尚未確認bug的形成到底需要什麼條件，有人認為是需要用冰火法術輪流攻擊。在act2和act4均有這樣的情況發生。act5尚未有此類報道。
㈡ 美國有甚麼航空航天一類的公司
波音 歷來是負責民用機的研製 從90年代處收購了麥,道開始轉向軍機也生產 但都是研製些比較失敗的型號
洛馬是美國軍機業的龍頭老大
諾思羅普-格魯曼 也是軍機市場上不可小瞧的一家公司 但因為B-2項目 導致諾思羅普-格魯曼現在不再生產軍機 主要生產一些其他產品 以戰斗機附屬產品為主 比方戰斗機雷達
所以美國本土現在形成兩大巨頭
波音 民航業 正在開發的產品 787 7E7
洛馬 正在發展的F-35
樓上說的雷神好象是負責導彈吧 不生產飛機
㈢ 「對不起」 用世界各國語言怎麼說
1、英語English: Sorry
2、日耳曼語Dutch: Droevig
3、法語French: Désolé
4、德語German: Traurig
5、希臘語Greek: Θλιβερ?ς
6、義大利語Italian: Spiacente
7、韓語Korean: mi ahn hae
8、葡萄牙語Portuguese (Brazilian): Pesaroso
9、俄羅斯語Russian: Огорченно
10、西班牙語Spanish: Apesambrado
11、日語Janpanese: ごめんなさい
12、泰文：ขอโทษ
13、印尼文／馬來文：minta maaf/mohon maaf
14、丹麥語：Danish: Undskyld!
15、菲律賓：Filipino - nagdaramdam
(3)ethpia擴展閱讀：
各國的我想你表示
英語：I miss you
韓語：보고싶다
日語：私はあなたを思って
法語：Je pense que vous
泰語：ฉันต้องการให้คุณ
德語：Ich Will, dass
義大利語：Voglio che tu
俄語：Я думаю, ты
葡萄牙語：EU Quero você
希臘語：σας χάνω
西班牙語：le falto
荷蘭語：Ik mis je
加利西亞語：Sinto saudades de ti
泰羅尼亞語：Et trobo a faltar
捷克語：Chybí mi
克羅埃西亞語：Nedostaje mi
拉脫維亞語：Man tevis pietrūkst
㈣ 世界上有那些植物
世界上的植物很多，有人說會超過35萬種，但真正定名的可能還不到10萬種。
動植物的分類有個系統，叫「門綱目科屬種」，植物稱為「界」，植物界，共分為四個「門」，即苔蘚植物門，蕨類植物門，裸子植物門，被子植物門。植物是在不斷進化的，有的滅絕，有的產生。這四類植物，以被子植物最高級，種類也最多，現在已經劃分的植物「科」，已經有幾百個，有的科內，就有上萬個種已經定名，最著名的就是菊科和禾本科等。
㈤ 求英文高手解題
1,D
根據第一段的第二句話「nothing about people---not their clothes, ideas, or languages—has changed as much as what they eat」，可以知道服裝，思想或者是語言的變化都沒有食物來的大，所以是D，food
2，C
這題考的是代詞，考代詞的話，你只要往句子前面找就好了，前一句是「In London, shops where chocolate drinks were served became important meeting places.」主語是shop，所以答案很容易就選出來了
3，D
這題是細節判斷題，根據這段「Ireland became so dependent on it that thousands of Irish people starved when the crop failed ring the 「Potato Famine(飢荒)」of 1845—1846, and thousands more were forced to leave their homeland and move to America.」人們對於土豆的依賴性很高，把它作為主食，但並不是只吃土豆，因為依賴性高，所以導致當土豆收成不好的時候，很多人就餓肚子了。（這題可以把土豆換成我們的主食大米來類比下）
4，C
細節題，文章中有句「Brazil is now the world』s largest grower of coffee」
5，A
細節題，文章中倒數第二段，有句「and coffee is an important crop in Colombia and other South American countries. But it is native to Ethiopia」可以知道，它應該是native to ethipopia
㈥ 世界上有多少種植物
據估計目前世界上大約有350000種植物。
植物有明顯的細胞壁和細胞核，其細胞壁由葡萄糖聚合物——纖維素構成。植物具有光合作用的能力——就是說它可以藉助光能及動物體內所不具備的葉綠素，利用水、礦物質和二氧化碳生產食物。釋放氧氣後，剩下葡萄糖——含有豐富能量的物質，作為植物細胞的組成部分。亞里斯多德將生物區分成植物（通常是不移動的）和動物（時常會移動去獲取食物）兩種。在林奈系統里，則被分為了植 物界和動物界兩界。
後來，人們漸漸了解過原本定義的植物界中包含了數個不相關的類群，並將真菌和數種藻類移至新的界去。然而，對於植物仍然有許多種看法，不論是在專業上的，還是在一般大眾的眼中來看。而也確實，若試圖要完美地將「植物」放至單一個分類里是會發生問題的，因為對於大多數的人而言，「植物」這一詞對現今分類學和系統分類學所立基的種系發生學的概念之間的關連性並不是很清楚,繁殖方法主要有壓條、分株、扦插、嫁接、種子、孢子等。
生命的起源是由化學物質構成的DNA和原生漿液。植物伊始距今二十五億年前（元古代），地球史上最早出現的植物屬於菌類和藻類，其後藻類一度非常繁盛。直到四億三千八百萬年前（志留紀），綠藻擺脫了水域環境的束縛，首次登陸大地，進化為裸蕨類植物和蕨類植物。為大地首次添上綠裝。
(6)ethpia擴展閱讀：
植物組成器官
組成器官
植物共有六大器官：根、莖、葉、花、果實、種子。莖是植物體中軸部分。直立或匍匐於水中，莖上生有分枝，分枝頂端具有分生細胞，進行頂端生長。莖一般分化成短的節和長的節間兩部分。莖具有輸導營養物質和水分以及支持葉、花和果實在一定空間的作用。有的莖還具有光合作用、貯藏營養物質和繁殖的功能。
葉是維管植物營養器官之一。功能為進行光合作用合成有機物，並有蒸騰作用提供根系從外界吸收水和礦質營養的動力。花是具有繁殖功能的變態短枝。果實主要是作為傳播種子的媒介。種子具有繁殖和傳播的作用，種子還有種種適於傳播或抵抗不良條件的結構，為植物的種族延續創造了良好的條件。
根
根是植物的營養器官，通常位於地表下面，負責吸收土壤裡面的水分及溶解其中的離子，並且具有支持、貯存合成有機物質的作用。（氣生根和固著根除外）根由薄壁組織、維管組織、保護組織、機械組織和分生組織細胞組成。
莖
莖是植物的營養器官之一。是大多數植物可見的主幹。當然，例如仙人掌的變態莖。莖下接根，通過木質部將根部吸收到的水分和礦物質往上運輸到各營養器官，通過韌皮部將光合作用的產物往下運輸。莖來源於植物胚胎的胚芽。胚軸組成部分的莖，准確地說是子葉下的部分。
葉
葉是高等植物的營養器官，側邊發育自植物的莖的葉原基。葉內含有葉綠素，是植物進行光合作用的主要場所。同時，植物的蒸散作用是通過葉的氣孔實現的。
果實
果實由花的雌蕊發育而來，多數植物的種子包裹在果實裡面。草莓的「果實」由花托生長而來，是一個例外。一個果實內部的種子數量各不相同，有些只有一籽，有些則很多。果實成熟時，有些富含水分，有些則變干。
種子
種子是種子植物的胚珠經受精後長成的結構，一般有種皮、胚和胚乳等組成。胚是種子中最主要的部分，萌發後長成新的個體。胚乳含有營養物質。
㈦ 各大航空公司運單號前綴都是多少啊
提單代碼 航空公司中文名稱 航空公司英文名稱 IATA代碼 國際代碼 所在地
000 伊朗馬漢航空 Mahan Airlines W5 伊朗
001 美國美洲航空公司 American Airlines AA AAL 秘魯
005 美國大陸航空公司 Continental Airlines CO COA 美國-得克薩斯-休斯敦
006 美國達美航空公司 Delta Air Lines DL DAL 美國-喬治亞-亞特蘭大
012 美國西北航空公司 Northwest Airlines NW NWA 美國-明尼蘇達-伊根
013 加彭航空 Gabon Airlines GY GBK 加彭利伯維爾
014 加拿大航空公司 Air Canada AC ACA 加拿大-蒙特利爾
016 美國聯合航空公司 United Airlines UA UAL 美國-伊利諾伊州
018 加拿大國際航空公司 Canadian Airlines Int′l CP 加拿大
020 德國漢莎航空 Lufthansa Cargo AG LH DLH 德國-法蘭克福
023 美聯邦航空公司 Fedex FX 美國
027 阿拉斯加航空公司 Alaska Airlines AS ASA 美國-阿拉斯加
037 美國航空公司 US Airways US USA 美國-得克薩斯-沃斯堡
040 喀麥隆航空公司 Camair-Co UY UYC 喀麥隆
041 捷星亞洲航空 Jetstar Asia Airways 3K JSA 新加坡
042 里約格朗德航空 VARIG RG VRG 巴西里約熱內盧
043 港龍航空公司 Dragon Air KA HDA 中國-香港
044 阿根廷航空公司 AEROLINEAS AR ARG 阿根廷-布宜諾斯艾利斯
045 智利航空 LAN Airlines LA LAN 智利-聖地亞哥
047 TAP葡萄牙航空 公司 TAP AIR PORTUQAL TP TAP 葡萄牙
048 塞普勒斯航空 Cyprus Airways CY CYP 塞普勒斯
050 希臘國營奧林匹克航空公司 Olympic Airways OA OAL 希臘
053 愛爾蘭航空公司 Aer Lingus EI EIN 愛爾蘭-都柏林
055 義大利航空公司 Alitalia AZ AZA 義大利
057 法國航空公司 Air France AF AFR 法國
061 塞席爾航空公司 Air Seychelles HM SEY 塞席爾
064 捷克航空公司 CSA Czech Airlines OK CSA 捷克
065 沙烏地阿拉伯航空公司 Saudi Arabian Airlines SV SVA 沙烏地阿拉伯航
070 敘利亞阿拉伯航空 Syrian Arab Airlines RB SYR 敘利亞
071 衣索比亞航空公司 Ethiopian airlines ET ETH 衣索比亞
072 海灣航空公司 Gulf Air GF GFA 巴林
074 荷蘭皇家航空公司 KLM KL KLM 荷蘭
075 西班牙航空公司 Iberia IB IBE 西班牙
076 黎巴嫩航空公司 Lebanese Air Transport LQ LAQ 黎巴嫩
077 埃及航空公司 Egyptair MS MSR 埃及
079 菲律賓航空公司 Philippine airlines PR PAL 菲律賓
080 波蘭航空公司 Lot Polish Airlines LO LOT 波蘭
081 快達航空公司 Qantas Airways QF QFA 美國
082 比利時航空公司 Brussels Airlines SN DAT 比利時
083 南非航空公司 South African Airways SA SAA 南非
086 紐西蘭航空公司 Air New Zealand NZ ANZ 紐西蘭
090 翠鳥航空有限公司 Kingfisher Airlines IT KFR 印度-班加羅爾
096 伊朗航空公司 Iran air IR IRA 伊朗
098 印度航空公司 Air India AI AIC 印度
105 芬蘭航空公司 Finnair Oyj AY FIN 芬蘭
106 西印度群島航空公司 BWIA West Indies Airways Limited BW BWA 西班牙
108 冰島航空公司 Iceland air FI ICE 冰島
112 中國貨運航空 China Cargo Airlines LTD. CK CKK 中國-上海
114 以色列航空公司 El Al Israel Airlines LY ELY 以色列
115 南斯拉夫航空 Jugoslovenski Aerotransport JU JAT 南斯拉夫
117 北歐航空公司 Scandinavian Airlines System SK SAS 瑞典斯德哥爾摩
118 安哥拉航空公司 TAAG – Linhas Aereas de Angola DT DTA 安哥拉-盧安達
119 ALM Airline Inc. Air ALM LM ALM 荷屬安的列斯
123 維珍航空 Virgin Atlantic Airways VS VIR 英國
124 阿爾及利亞航空公司 Air Algerie AH DAH 阿爾及利亞-阿爾及爾
125 英國航空公司 British Airways p.l.c. BA BAW 英國-倫敦
126 印尼航空 Garuda Indonesia GA GIA 印尼-雅加達
127 Aviaprima Sochi Airlines Aviaprima Sochi Airlines J5 PRL 希臘
128 香港快運航空公司 HONGkONG EXPRESS UO HKE 中國-香港
129 荷蘭馬丁航空公司 Martinair Cargo MP MPH 荷蘭-阿姆斯特丹
131 日本航空公司 Japan Airlines Company Ltd. JL JAL 日本-東京
132 墨西哥聯運航空公司 Aeroméxico Cargo MX MXA 墨西哥
136 古巴航空公司 Cubana de Aviacion S.A. CU CUB 古巴
139 墨西哥航空公司 Aeromexico Cargo AM AMX 墨西哥
140 秘魯 LIAT 航空公司 LIAT Airlines LI LIA 秘魯
141 迪拜航空公司 Fly FZ FDB 迪拜
145 拉德科智利航空 Royal Air Maroc UC LCO 智利
147 摩洛哥皇家航空公司 Royal Air Maroc AT RAM 摩洛哥-達爾貝達
155 敦豪航空公司 DHL International E.C. ES DHX 中國-北京
157 卡達航空公司 Qatar Airways (W.L.L.) QR QTR
160 香港國泰航空有限公司 Cathay Pacific Airways Ltd. CX CPA 中國-香港
163 比利時 TNT航空公司 TNT Airways 3V TAY 比利時
165 斯洛維尼亞國際航空公司 Adria Airways – The Airline of Slovenia JP ADR 斯洛維尼亞
167 馬拉維航空公司 Air Malawi QM AML 馬拉維布蘭太爾
172 盧森堡航空公司 Cargolux Airlines International CV CVA 盧森堡-芬德爾機場
173 夏威夷航空 Hawaiian Airlines HA HAL 美國-夏威夷
176 阿聯酋航空公司 Emirates EK UAE 阿聯酋-迪拜
180 大韓航空公司 Korean Air Lines Co. Ltd. KE KAL 韓國
183 里約格朗德航空 VARIG RG VRG 巴西里約熱內盧
186 納米比亞航空 Air Namibia SW NMB 納米比亞-溫得和克
195 普爾科沃航空公司 Pulkovo Aviation Enterprise Z8 PLK 俄羅斯-聖彼得堡
201 牙買加航空有限公司 Air Jamaica JM AJM 牙買加-金斯敦
202 塔卡國際航空公司 TACA International Airlines TA TAI 薩爾瓦多
203 菲律賓宿務航空公司 Cebu Pacific Air 5J CPI 中國
205 日本全日空航空公司 ANA All Nippon Airways NH ANA 日本-東京
214 巴基斯坦航空公司 Pakistan International Airlines PK PIA 巴基斯坦
217 泰國航空公司 Thai Airways International Public TG THA 泰國-曼谷
229 科威特航空公司 Kuwait Airways KU KAC 科威特
230 巴拿馬航空公司 COPA Airlines CM CMP 巴拿馬
231 維也納勞達航空公司 Lauda Air NG LDA 奧地利施韋夏特
232 馬來西亞航空公司 Malaysian Airline System Berhad MH MAS 馬來西亞-吉隆坡
234 日本佳速航空貨運 Japan Air System JD JAS 東京
235 土耳其航空公司 Turkish Airlines Inc. TK THY 土耳其-伊斯坦布爾
236 英國大陸航空公司 British Midland Airways Ltd. BD BMA 英國
239 模里西斯航空有限公司 Air Mauritius MK MAU 模里西斯-路易港
254 Jetclub航空 Jet Club 0J JCS 瑞士蘇黎世
257 奧地利航空公司 Austrian Cargo OS AUA 奧地利
258 馬爾加什國家航空 Air Madagascar MD MDG 馬達加斯加
265 遠東航空公司 Far Eastern Air Transport FE FEA 中國台北
266 Leisure航空 Leisure Cargo L8 德國
270 跨地中海航空公司 Trans Mediterranean Airways TL TMA 黎巴嫩
272 卡利塔航空 Kalitta Air K4 CKS 美國
279 捷藍航空 JetBlue Airways B6 JBU 美國-紐約
281 羅馬尼亞航空 Tarom RO ROT 羅馬尼亞
288 香港華民航空公司 Air Hong Kong LD AHK 中國香港
297 台灣中華航空公司 China Airlines CI CAL 中國-台灣
301 全球航空服務 Global Aviation and Services 5S GAK 利比亞
302 美國 SkyWest 航空公司 Sky West Airlines OO SKW 美國
307 聖圖倫貨運航空 Centurion Air Cargo WE CWC 美國
312 印地高航空 IndiGo CarGo 6E 印度
317 聯盟航空公司 Alliance Airlines 3A AFJ 美國
318 冰島亞特蘭大航空 Air Atlanta Icelandic CC ABD 冰島
321 德國星光航空公司 Starlight Airlines QP 德國
324 山東航空 Shandong Airlines Co.,Ltd. SC CDG 中國-濟南
328 挪威航空 Norwegian Air Shuttle DY NAX 挪威-奧斯陸
331 SATA航空 SATA INTERNATIONAL S4 RZO 聖米格爾
345 北方貨運航空公司 Northern Air Cargo NC NAC 美國
355 郵件空運航空 Estafeta Carga Aerea E7 ESF 墨西哥
356 盧森堡國際貨運航空公司 Cargolux Italia C8 ESF 盧森堡
369 美國阿特拉斯航空公司 Atlas Air, Inc. 5Y GTI 美國
370 跨地中海航空公司 Trans Mediterranean Airways TL TMA 摩爾多瓦
378 開曼航空 Cayman Airways KX CAY 開曼群島
390 希臘愛琴海航空 Aegean Airlines A3 AEE 希臘-雅典
403 極地航空貨運全球有限公司 Polar Air Cargo PO PAC 美國-紐約州-帕切斯
406 聯合包裹航空公司 United Parcel Service 5X UPS 美國
416 National航空 National Air Cargo N8 NCR 美國
417 中南美空運 Bringer Air Cargo E6 BRC 巴西
421 西伯利亞航空公司 Siberia Airlines S7 SBI 俄羅斯-莫斯科
423 敦豪航空公司 DHL Aviation/DHL Airways ER DHL 德國北萊茵
463 亞塞拜然絲綢之路 Silk Way Airlines ZP AZQ 亞塞拜然
465 阿斯塔納航空公司 Air Astana KC 哈薩克-阿斯塔納
474 加那利航空公司 BinterSwift Cargo NT IBB 加那利群島
479 深圳航空公司 Shenzhen Airlines ZH CSZ
485 Astral航空 Astral Aviation 8V ACP 肯亞
489 噴氣貨運航空公司 Cargojet Airways W8 CJT 加拿大
501 絲綢之路航空 Silk Way West Airlines 7L 亞塞拜然巴庫
507 俄羅斯航空 Aeroflot Russian Airlines SU AFL 俄羅斯
512 約旦皇家航空 Royal Jordanian RJ RJA 約旦-安曼
514 阿拉伯航空 Air Arabia G9 ABY 阿拉伯聯合大公國沙迦
519 尼泊爾航空公司 Nepal Airlines RA KTM 尼泊爾
524 澳大利亞航空快遞公司 Australian air Express XM JLJ 日本
525 台灣立榮航空 EVA Airways B7 UIA 中國-台灣
526 美國西南航空公司 Southwest Airlines WN SWA 美國-達拉斯
549 巴西 ABSA 航空公司 ABSA Aerolinhas Brasileiras M3 TUS 巴西-坎皮納斯
552 Mario\』s航空公司 Mario\』s Air M2 佛羅里達州
555 俄羅斯航空公司 Aeroflot Russian Airlines SU AFL 俄羅斯-莫斯科
566 烏克蘭國際航空公司 Ukraine International Airlines PS AUI 烏克蘭-基輔
572 摩爾多瓦航空公司 Air Moldova 9U MLD 摩爾多瓦基希訥烏
574 聯盟航空 Allied Air AJK 奈及利亞-拉各斯
575 英國 Coyne Air公司 Coyne Air 7C COY 英國
576 Skylease航空 Skylease Cargo KY
578 泰國東方航空 Orient Thai Airlines OX OEA 泰國
580 俄羅斯空橋貨運航空公司 Airbridge cargo RU ABW 俄羅斯
589 印度傑特航空公司 Jet Airways (India) Limited 9W JAI 印度
603 斯里蘭卡航空公司 SriLankan Airlines Limited UL ALK 斯里蘭卡-科倫坡
607 阿聯酋阿提哈德航空公司 Etihad cristal cargo EY ETD 阿聯酋-阿布扎比
615 DHL航空 DHL Aviation GL GRL 德國
618 新加坡航空公司 Singapore Airlines SQ SIA 新加坡
623 保加利亞航空 Bulgaria Air FB LZB 保加利亞
624 巴西天馬航空 Pegasus Cargo PC 巴西
629 新加坡航空公司 Silk Air MI 新加坡
630 托馬斯庫克航空 Thomas Cook Airlines Scandinavia DK VKG 丹麥-哥本哈根
631 格陵蘭航空公司 Air Greenland GL GRL 丹麥-努克
635 葉門航空 Yemenia Airlines IY IYE 葉門
642 墨西哥航空貨運 Aeroméxico Cargo QO 墨西哥
643 馬爾他航空 Air Malta KM AMC 馬爾他 -魯卡
644 Solar Cargo航空 Solar Cargo
649 越洋航空 Air Transat TS TSC 加拿大
656 新幾內亞航空 Air Niugini PX ANG
657 波羅的海航空 Air Baltic BT BTI 拉脫維亞-里加
670 香港空運貨站有限公司 UO
672 汶萊航空公司 Royal Brunei Airlines BI RBA 汶萊 -斯里巴加灣
673 地中海航空公司 TMA Trans Mediterranean Airways N2
675 澳門航空有限公司 Air Macau Company Limited NX AMU 中國-澳門
687 阿羅哈航空貨運 Aloha Air Cargo KH AAH 美國
695 台灣長榮航空 EVA Airways BR EVA 中國-台灣
700 中國貨運航空 C.A.L. Cargo Airlines Ltd. 5C CAL 中國-上海
706 肯亞航空公司 Kendell Airlines KQ KQA 肯亞-內羅畢
710 阿班航空 Aban Air K5 ABE 伊朗
711 Movie Reviews Movie Reviews MR
716 土耳其 MNB 航空公司 MNG Cargo Airlines MB MNB 土耳其
723 墨西哥聯運航空公司 Aeroméxico Cargo QO 墨西哥
724 瑞士國際航空公司 Swiss International Air Lines LX SWR 瑞士-巴塞爾
729 坦帕航空貨運 Tampa Cargo QT TPA 比利時
730 德國航空貨運 ACG Air Cargo Germany 6U ACG 德國-哈恩
731 廈門航空公司 XiaMen Airlines MF CXA 中國-廈門
738 越南國家航空公司 Vietnam Airlines VN HVN 越南河內
745 柏林航空 Air Berlin AB BER
749 南非支線航空公司 SA Airlink Airlines 4Z LNK
754 途易航空 Jetairfly TB TUB 比利時
756 比利時 TNT航空公司 TNT Airways 3V TAY 比利時-列日
757 Avient Avient Z3 SMJ
767 大西洋航空 Atlantic Airways RC FLI 丹麥
771 亞塞拜然航空公司 Azerjan Airlines J2 AHY 亞塞拜然-巴庫
774 上海航空公司 Shanghai Airlines FM CSH 中國-上海
775 森帕蒂航空公司 spiceJet SG
781 中國東方航空公司 China Eastern Airlines MU CES 中國-上海
784 中國南方航空公司 China Southern Airlines CZ CSN 中國-廣州
790 馬斯航空 MASAir 1A Leaderjet 墨西哥
800 銀河國際貨運航空有限公司 Grandstar Cargo GD GSC 中國-天津
803 華信航空公司 Mandarin Airlines AE MDA 中國-台灣
807 亞洲航空公司 AirAsia Berhad AK AXM 馬來西亞-吉隆坡
810 美國噴氣國際公司 Amerijet International M6 AJT 美國
827 魯斯航空公司 RUS Aviation R4 立陶宛
831 克羅的亞航空 Croatia Airlines OU CTN 克羅的亞
843 亞洲航空 AirAsia D7 KUL 馬來西亞
851 香港航空 Hong Kong Airways HX CRK 香港
858 西非航空公司 Africa West FK WTA 英國
862 美國達美航空公司 Atlantic Southeast Airlines EV CAA 美國-亞特蘭大
865 墨西哥麥斯航空 MASAir MY MWA 墨西哥-墨西哥
870 烏克蘭空中世界航空公司 Aerosvit Airlines VV AEW 烏克蘭-基輔
871 揚子江快運航空有限公司 Yangtze River Express Co. Ltd Y8 YZR 中國-上海
876 四川航空 Sichuan Airlines Co.,Ltd. 3U CSC 中國-成都
880 海南航空公司 Hainan Airlines HU CHH 中國-海口
886 美國 Comair 航空公司 Comair OH COM 美國
900 馬爾地夫航空 Air Maldives L6 AMI 馬爾地夫
901 玻利維亞航空 TAB Transportes Aereos Bolivianos B1 BOL 玻利維亞
907 皇家航空 Air Armenia QN ARR 亞美尼亞
910 阿曼航空公司 Oman Air WY OAS 馬斯喀特
932 英國維珍航空公司 Virgin Atlantic Airways Limited VS VIR 英國-倫敦
933 日本貨運航空公司 Nippon Cargo Airlines KZ NCA 日本-東京
946 Vensecar國際航空 Vensecar V4 VEC 委內瑞拉
947 瓜地馬拉DHL DHL de Guatemala L3 JOS 瓜地馬拉
950 CHAMP-Test XS
957 巴西塔姆航空公司 TAM Linhas Aereas JJ TAM 巴西
958 Insel Air Cargo Insel Air Cargo 7I INC 庫拉索島
960 愛沙尼亞航空 Estonian Air OV ELL 愛沙尼亞-塔林
976 墨西哥聯運航空 Aeromexpress Cargo QO 墨西哥
988 韓亞航空公司 Asiana Airlines OZ AAR 韓國-首爾
989 長城航空公司 Great Wall Airlines IJ GWL 中國-上海
991 吉布地航空 Daallo Airlines D3 吉布地
992 巴拿馬 敦豪航空 DHL Aero Expreso D5 DAE 巴拿馬
996 歐洲貨運航空公司 Air Europa Cargo UX AEA 西班牙
997 孟加拉航空 Biman Bangladesh BG BBC 孟加拉國-達卡
999 中國國際貨運航空有限公司 Air China International Corporation CA CAO 中國-北京
㈧ 哪位做過脂肪細胞原代培養
方案 23.12 脂肪細胞的原代培養
實驗材料
DMEM-ADMEM-B膠原蛋白酶雄性 Sprague-Dawley 大鼠
試劑、試劑盒
KRBH緩沖液KRBH-A緩沖液
儀器、耗材
Petri培養皿錐形離心管聚丙烯管低密度聚丙烯瓶尼龍濾網尖解剖剪Perry鑷塑料箱鍘刀移液器
實驗步驟
一、切除附睾脂肪墊
1. 在充有 70 % CO2和 30 % O2混合氣體的塑料箱內麻醉大鼠（雄性 Sprague-Dawley 大鼠：145~170 g，CD 系（Charles River Breeding Laboratories）。
2. 用鍘刀斷頭放血。
3. 將鼠體在 70 % 乙醇內浸泡一會兒。
4. 盡量在無菌條件下切除附睾脂肪墊。
(a)用一把解剖剪剖開下腹部皮膚，暴露腹膜。
(b)用另一把解剖剪剖開腹膜，然後用 Perry 鑷向上牽拉睾丸。
(c)剪取附睾脂肪墊，注意保留血管。
5. 將組織移送到培養實驗室。
脂肪細胞的膠原蛋白酶（在 2 ml KRBH 緩沖液加入 20 mg/ml 膠原蛋白酶，然後用 0.22 μm 濾器過濾）消化和洗滌
6. 將 4 g 脂肪墊（相當於 8 個附睾的脂肪墊）放入盛有 4 ml KRBH 緩沖液 （Krebs-Ringer 液，pH 7.4，添加 10 mmol/L NaHCO3、30 mmol/L HEPES（Sigma）、200 nmol/L 腺苷（Boche）和 1 % BSA （W / V，Intergen）。配製 1 L KRBH 緩沖液時，用 7 g NaCl、0.55 g KH2PO4、0.25 g MgSO47H2O、0.84 g NaHCO3、0.11 g CaCl2、7.15 g HEPES、10 g BSA、1 ml 200 μmol/L 腺苷， 加超凈水至 1 L。然後，按 100 ml 分裝。使用前加熱至 37°C，並將 pH 調整至 7.4。）（37°C）的 30 ml 低密度聚丙烯瓶內。
7. 將脂肪墊剪成直徑約為 2 mm 的組織塊。
8. 將組織塊放入瓶內，然後加入 1 ml 膠原蛋白酶液。在 37°C 水浴振盪器孵育約 1 h，直至細胞混合物形成乳脂樣濃稠液體。
9. 膠原蛋白酶消化後，向瓶內加入 4 ml KRBH 緩沖液（37°C）。
10. 通過攪拌混勻瓶內的細胞，然後用孔徑為 250 μm 的尼龍濾網（孔徑為 250 μm，放入支持物或漏斗內）將細胞輕輕濾入 50 ml 錐形離心管。
11. 通過向離心管內加入 30 ml KRBH 緩沖液（37°C）洗細胞。用台式離心機短時間離心（ 200 g），然後用吸管吸出下清液。注意脂肪細胞浮在水性緩沖液的上面。
12. 通過加入 40 ml KRBH 緩沖液洗細胞，離心，除去下清液。重復該步驟 1 次。
13. 用 40 ml DMEM-A （DMEM，pH 7.4，添加 25 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨醯胺、200 nmol/L（R )-N6-（l-methyl-2-phenylethyl）腺苷（PIA，Sigma）、100 μg/ml 慶大黴素和 25 mmol/L HEPES。按 100 ml 分裝，使用前加熱至 37°C）（37°C）洗細胞 2 次。
14. 用約 40 % cytocrit DMEM-A 混懸漂浮的細胞。
二、脂肪細胞的原代培養
15. 用 200 μl 大口徑吸頭將 2 ml 40 % cytocrit DMEM-A 懸液移入 60 mm 培養皿。
16. 將培養皿放入濕潤的培養箱，在 37°C 和 5 % CO2的條件下培養 1.5 h 。
17. 向培養皿內加入 5 ml DMEM-B（DMEM-A，添加 7% BSA）。
此時，應進行葡萄糖攝取實驗 [ Quom 1998 ]，檢査細胞的活力。
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中山醫科大學學報(AcadJSUMS),2001,22(6):443~446443
人前脂肪細胞的原代培養
王竹晨1,劉建中2,李??燕2,楊冬梓1,鄺健全1
(中山醫科大學??1.孫逸仙紀念醫院婦產科,2.生物教研室,廣東廣州??510120)
摘??要:??目的 建立人前脂肪細胞原代培養方法,以更深入地研究人體脂肪組織增生的生物學特徵。??方法 選用成人的腹部脂肪組織,採用原代消化細胞培養法培養出棱形細胞;同時取皮膚組織,進行成纖維細胞培養作為對照。??結果 培養出的棱形細胞成分均一,增殖旺盛,分化率高。經形態學動態變化的觀察,生長曲線及油紅O脂肪染色抽取法測定,證明是功能活躍的前脂肪細胞,並在體外重現了其增殖的全過程。??結論 在成熟的脂肪組織中存在著可分化成熟、生成脂肪的前脂肪細胞。由於脂肪細胞是胰島素作用的經典靶細胞之一,本實驗為進一步研究與肥胖及胰島素抵抗相關的疾病如多囊卵巢綜合症等打下了基礎。
關鍵詞:前脂肪細胞;細胞培養;脂肪組織
中圖分類號:Q254,R711.75??????文獻標識碼:A??????文章編號:1000-257X(2001)06-0443-04
WANGZhu??chen1,LIUJian??zhong2,LIYan2,YANGDong??zi1,KUANGJian??quan1
(1.,SunYat??senMemorialHospital,2.DepartmentofBiology,
SunYat??,Guangzhou510120,China)
Abstract:??Objective .??Methods Usingprimarycellculture,fibroblast??..??Results Thecellswerehighlyhomogeneous,.,growthcurve,,.Undercontrolledconditions,.??Conclusion Inmaturehumanadiposetissue,.,thisstudylaidthebasisforfur??syndrome.
Keywords:preadipocyte;cellculture;adiposetissue
????脂肪細胞是胰島素作用的經典靶細胞之一,與
肥胖及胰島素抵抗相關疾患如多囊卵巢綜合症的
研究關系密切,近年來受到婦科內分泌領域的重
視。前脂肪細胞是一類具有增殖和向脂肪細胞分
化能力的特異化的前體細胞,它的存在和作用持續
於人的一生,我們從人脂肪組織中培養出了前脂肪
細胞,為進一步研究打下了基礎。
????收稿日期:2001-04-23
????基金項目:廣東省衛生廳科研基金資助課題(2001189)
????,;1??材料與方法1.1??組織來源選取2000年9月~2001年1月本院婦科內分泌病房行輸卵管復通術的正常體重患者。年齡20~40歲,身體健康,無其他急慢性疾病。術中開腹時切取皮下脂肪組織及皮膚組織。
444
1.2??試驗材料
1.2.1??主要試驗用品和化學試劑??DMEM/F??12培養基(1!1),無支原體胎牛血清,?型膠原酶,Hepes,人轉鐵蛋白,青、鏈黴素原液均購自GIBCO公司;生物素、泛酸鹽、氫化可的松,三碘甲狀腺原胺酸(T3),3??異丁基??1??甲基黃嘌呤均系SIGMA公司產品。牛血清白蛋白購自Roche公司。試驗所需無機試劑購自廣州市醫葯公司化試批發部,均系分析純試劑。培養瓶購自KORNING公司。
1.2.2??培養基及主要試劑的配製??培養基A[1]中山醫科大學學報(AcadJSUMS),2001,22(6)培養基A製成細胞懸液,接種至25cm2培養瓶內,密度為每平方厘米3?10個細胞,置37#,體積分數5%CO2培養箱內孵育16h後,PBS輕輕洗去培養瓶內未粘附的物質,換用培養基C誘導和維持脂肪細胞分化,3d後更換為培養基B,以後每2~3d更換一次培養基B。1.3.2??人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞的組織學染色??蓋玻片剪成0??5cm?1??0cm大小,接種時置入培養瓶內,待細胞貼壁後每2、3d從培養瓶內取出染色。將貼有脂肪細胞的面朝上,浸入體積分
數為10%甲醛的等滲鹽緩沖液中固定10min,然後放入PBS緩沖液中,輕輕漂洗片刻,直立使殘留水份流到邊緣,吸水紙吸掉。稍乾燥後,人前脂肪細胞採用蘇丹%??&滴染法及Mayer蘇木素復染細胞核,甘油明膠封片;皮膚成纖維細胞採用常規蘇木素-伊紅染色,脫水透明後中性樹脂封片,光鏡觀察並拍照保留結果。
1.3.3??細胞生長曲線的繪制??將細胞懸液等量接種至24個培養瓶內,隨機分成8組,每組3瓶,每2d檢測一組中每個瓶中的細胞總數,取3個瓶的均值,如此至第8組結束。細胞計數方法參照醫學細胞生物學實驗[3]。
1.3.4??油紅O染色提取法測定細胞內的脂肪含量??接種方法同1.3.3,根據Ramirez[2]4:按說明取DMEM/F??12培養粉5g,加入胎牛血清使其體積分數為10%,三蒸水定容至500mL;培養基B:按說明取DMEM/F??12培養粉10g,加入終濃度分別為15mmol/LNaHCO3,15mmol/LHep??es,33??mol/L泛酸鹽,17??mol/L人轉鐵蛋白,100000U/L青黴素,0??1g/L鏈黴素,100nmol/L氫化可的松,60nmol/L胰島素,0??2nmol/LT3,三蒸水定容至1000mL;培養基C:取培養基A200mL,加入3??異丁基??1??甲基黃嘌呤,使其終濃度為0??25mmol/L;消化液:稱取膠原酶(?型)150mg,牛血清白蛋白2g,0??01mol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)定容至100mL;紅細胞溶解緩沖液:稱取適量NH4Cl,K2HPO4和EDTA,使其終濃度分別為154mmol/L,5??7mmol/L,和0??1mmol/L,三蒸水
定容至250mL。上述溶液均經調整pH值至7??4~7??6,0??22??m微孔濾膜正壓過濾除菌,分裝後置-30#保存。油紅O工作液[2]等的方法測定。培養物用體積分數10%甲醛的等滲鹽緩沖液固定1h後,蒸餾水漂洗。吸取油紅O工作液10mL,使培養面向下浸染,2h後倒掉瓶內的油紅O
工作液,蒸餾水漂洗培養瓶數次,直至完全漂浮干凈。將已染色的培養瓶置於32#孵箱內蒸發掉瓶內的水份後即加入1mL異丙醇,萃取出的染液即刻用吸管移出,於HITACHIG2000型分光光度計510nm波長處測吸光度。:稱取4??2g油紅O溶於1200mL異丙醇中室溫靜置過夜,分析濾紙過濾後收集濾液,並加入900mL三蒸水,於4#再次靜置過夜後過濾兩次即可於室溫貯存備用。1.2.3??儀??器??CO2培養箱,倒置顯微鏡等。1.3??方??法
1.3.1??人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞的原代培養[1]??術中切取脂肪組織約60g,同時切取皮膚組織約0??5cm?3cm進行成纖維細胞培養作為對照。PBS洗滌,分離去除脂肪組織中肉眼可見的纖維成份及血管,皮膚組織則需去除表皮和皮下脂肪,剪碎成約2mm?2mm的小塊,加入消化液,置37#,體積分數5%CO2培養箱內消化。15h後,200?g短時離心,去除漂浮的脂肪細胞及培養液,沉積的細胞用紅細胞溶解緩沖液再次配成細胞懸液,37#孵育10min,以去除污染的紅細胞,150??2??結??果2.1??原代培養的人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞形態學觀察細胞貼壁後初為小圓形,核/漿比例較大(圖1??1),4d即可觀察到細胞漸成梭型,7d左右此棱形細胞大量繁殖,面積達到培養瓶底1/2之後開始積聚脂肪顆粒(圖1??2)。9d可觀察到細胞由棱形漸變成橢圓形或圓形(圖1??3),積聚有脂肪顆粒的
第6期??王竹晨,等.人前脂肪細胞的原代培養445肪細胞(圖1??4)。體外培養的脂肪細胞體積較大,細胞膜較薄,膜輪廓不光滑,凹凸不平有皺折,胞質內有大量圓形脂滴,大小不等且多散在,也有小脂滴大量觸合成大脂滴的情況,核仍位於邊緣,而同時培養的皮膚成纖維細胞增殖速率相似,但始終為長棱形,無脂滴積聚(圖2??1,圖2??2)。
2.2??人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞的生長曲線
由生長曲線可見人前脂肪細胞(圖3??1)和皮膚成纖維細胞(圖3??2)的倍增時間分別為60h和55h
。3??討??論3.1??人前脂肪細胞培養在婦科內分泌領域的研究意義脂肪細胞是脂肪組織的重要組成部份,也是其發揮功能的主體。當代研究認為脂肪組織中脂肪細胞非常活躍,細胞的數目,形態及細胞內脂肪的含量均處於動態變化之中,並保持終生。肥胖症被認為是脂肪細胞增殖和分化失控的結果。目前,肥
胖已成為與婦科內分泌領域密切相關的疾病,肥胖可產生胰島素抵抗/高胰島素血症,而胰島素抵抗/高胰島素血症是許多臨床疾病或病症,尤其是常見的內分泌代謝性疾病如糖尿病、高血壓和動脈粥樣硬化等的共同危險信號,因此成為近年醫學多學科共同感興趣的研究熱點。特別是近年的研究發現
圖3.1??人前脂肪細胞生長曲線
Fig.3.1??
culture胰島素抵抗/高胰島素血症還與育齡婦女高雄激素血症及無排卵有關。臨床常見的多囊卵巢綜合症,
生育年齡婦女中約有5%~10%患者此症,常伴有肥胖,病因不明。目前認為多囊卵巢綜合症即是以胰島素抵抗為特徵的內分泌代謝性疾患,繼發於胰島素抵抗的高胰島素血症對造成高雄激素徵象起著重要作用,並致不孕[4]。脂肪細胞作為對胰島素
圖3.2??人皮膚成纖維細胞生長曲線
Fig.3.2??敏感的靶細胞之一,因此對其潛在胰島素抵抗機制的研究具有特殊臨床意義。體外前脂肪細胞培養
能完整地認識脂肪組織的發生和增生的全過程,並且可以直接觀察各種因素對這個過程的調控,研究其機制,是研究脂肪組織的理想模型。國外雖已建立了來源於鼠的前脂肪細胞的細胞株如3T3??L1、3T3??F442A,ob17系列等,但到目前為止,尚未見有人的前脂肪細胞株建立[5],因而使進一步的研究受到了限制。
3.2??體外培養的人前脂肪細胞的生物學特性
目前國內外前脂肪細胞體外培養系統大致有兩類,一類來源於血管基質組份細胞(stromalvas??cularfraction,SVF),這是經典的前脂肪細胞。Van等[6]對SVF的系統研究形成了完整的前脂肪細胞理論。他們將切下的脂肪組織用膠原酶處理,再將組織懸液離心,其中的沉澱物基質血管成份即是SVF,將其SVF進行培養,和培養的成纖維細胞比較,這兩種培養物以差不多的速率增殖,倍增時間約55h左右。在顯微鏡下比較細胞,發現起初2.3??前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞生長過程中細胞內脂肪含量的變化前脂肪細胞內的脂肪含量於培養9d後迅速增加,16d左右到達高峰,而皮膚成纖維細胞內僅有極少的脂肪積聚(圖4)
。圖4??前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞生長過程中細胞內脂肪含量的變化Fig.4??lture
446
可積聚大量脂滴,而成纖維細胞的胞漿內則無或只有少量的脂滴。這就證明了SVF是具有增殖和向脂肪細胞分化潛能的前脂肪細胞。本實驗研究結果與之相符,符合文獻中提出的3個標准[6]。此外,近年還有人報道採用脂肪組織塊貼壁和天花板培養相結合的方法也獲得了成功[7]。此種方法得到的前脂肪細胞與SVF不同,可能來源於Carraro等發現的成熟脂肪細胞內都有的一種細胞島[8]。但此種方法是採用有血清培養並且與成熟脂肪細胞共同孵育,不適於作為成熟脂肪細胞所分泌的某些細胞因子的體外研究模型。
前脂肪細胞的培養闡明了其增殖和分化的關系,目前認為這是一種生長停頓?生長再續?細胞分化的連續關系。生長停頓是必要的第一步,此後這些細胞至少進行一次以上的再分裂,才繼續向成熟脂肪細胞轉化。並隨時間的推移出現甘油??3??磷酸脫氫酶(GPDH)mRNA這個晚期標志物,這也是脂肪合成所必需的限速酶,並最終變成脂肪細胞。我們的研究也觀察到細胞貼壁後經過一段時間的潛伏期後開始生長,3、5d左右大量增殖,1周後開始有脂肪顆粒的積聚。培養2周時,分化成多脂滴或單脂滴的脂肪細胞,與文獻報道一致。
油紅O染色提取法可簡便、快速地對體外培養的前脂肪細胞轉化率進行定量。文獻報道其准確性和敏感性與測定前脂肪細胞分化過程中的標志酶GPDH相似[2]。因此常用來作為對體外培養的前脂肪細胞進行鑒定。體外培養的前脂肪細胞在胰島素、氫化可的松等的作用下,GPDH即開始上升並迅速增加,8d左右達到高峰並維持在高水平[2]。我們採用油紅O染色提取法進行研究,結果表明,前脂肪細胞在培養第3天即開始有脂肪的積聚,1周後積聚量明顯增多,2周時達到高峰,與形態學上的培養1周後細胞內開始出現脂肪顆粒相吻合。並說明酶的出現在先,脂肪出現在後,細胞內脂肪含量的明顯增加比GPDH的出現要晚1周左右,與文獻報道相吻合[2]。
3.3??人前脂肪細胞培養技術的特點
脂肪組織來源於原始的網狀結締組織,由結締組織和脂肪細胞組成,細胞成分中以脂肪細胞為主,此外還含有網狀細胞,間充質細胞,組織細胞,內皮細胞等。脂肪細胞和成纖維細胞均來自中胚層,因此培養脂肪細胞和培養成纖維細胞具有相似[9]中山醫科大學學報(AcadJSUMS),2001,22(6)外培養條件有差異[10],不同的是需要促脂肪形成因子的作用,目前已知的這類物質有:胰島素、糖皮質激素、甲狀腺素、生長激素、轉鐵蛋白,3??異丁基??1??甲基黃嘌呤,纖維粘連素等。培養基一般採用DMEM和F12按1!1比例配製,細胞數量適中,初次接種時細胞貼壁不十分牢固,動作要輕柔以免細胞漂浮。選用的取材對象越年輕越容易生長。人類一般選用外科手術切取腹部脂肪組織,如用注射器抽吸則易損傷細胞,降低成活率。(本文圖1,2見插頁2)參考文獻:[1]HaunerH,PetruschkeTH,RussM,etal.(TNF??)??[J].Dibetologia,1995,38(7):764.[2]Ramirez??ZacariasJL,Castro??MunozledoF,kuri??Har??cuchW.??[J].Histochemistry,1992,97(6):493.[3]趙??剛,劉建中.醫學細胞生物學實驗與習題[M].北京:科學出版社,1999.35.[4]DunaifA.??drome[J].Endocrinol&MetabClinNorAm,1999,28(2):341.[5]BillingsE,MayJW.Historicalreviewandpresentsta????constructivesurgery[J].PlastReconstrSurg,1989,83(2):368.[6]VanRLR,BaylissCE,RoncariDAK.rsinculture[J].JClinInvest,1976,58(9):699.[7]朱曉海,何清濂,林子豪.人前脂肪細胞培養及增殖與分化模型的建立[J].中華整型燒傷外科雜志,1999,15(3):199.[8]CarraroR,LiZH,JohnsonJE.ntratadipocytes[J].CellTissRes,1991,264(2):243.[9]劉??清,鄧漪平.內皮-平滑肌聯合培養:細胞間相互作用對組織型纖溶酶原激活劑的影響[J].中山醫科大學學報,1992,13(4):18.[10]朱永源,利天增,蘇愛雲,等.人表皮細胞的體外培養[J].中山醫科大學學報,1998,19增刊:34.(??,)