trx硫氧還原蛋白檢測試劑盒

⑴ 質粒圖譜怎麼看

1.第一步，看箭頭：

大多數質粒都會有箭頭，箭頭有兩種解釋。一種是轉錄方向，轉錄方向主要是由啟動子開始的一個大箭頭，是啟動子啟動序列的順序。另一種是復制起始位點的方向，復制起始位點就是該質粒在大腸桿菌等細菌或真菌中DNA復制的一個方向。

還需要提到的是F1啟動子（圖上的f1 ori）代表的是噬菌體的復制起始方向，只能復制出單鏈的DNA哦，但是可以用來測序。看懂轉錄的方向，這樣就方便設計插入片段的位置和方向性。

2.第二步，看上面的標簽。

報告基因：通常會有一兩個蛋白，被用作報告基因，比如常見的copGFP（綠色熒光蛋白），Puro（嘌呤黴素），Lacz（乳糖操縱子）等等。和抗性基因不同，這樣的報告基因，並不是為了在大腸桿菌擴增質粒的過程中起作用的。

而是在質粒轉入表達體系後起到作用的，基本上就是為了顯示過表達或是敲減的基因是否正常運作。有的報告基因會融合在蛋白中表達，有的會另外用一個獨立的啟動子進行表達（比如shRNA的質粒中）。

3.第三步，看多克隆位點：

MCS（Multiple Cloning Site，也就是多克隆位點），一般圖中會把多克隆位點上的酶切位點都標記出來。上面的酶切位點順序，一般都是按照5`-3`的順序排列下來的，需要注意的是這樣幾點。

第一點是要注意，酶切位點邊標注了*的一般是指並不僅僅存在一個位點，也就不能用來作為構建質粒的酶切位點。

第二點需要注意的是，有的酶切位點，在序列中只有一個，但它上面也會標注一個*或者（dam），這說明可能這個酶切位點會有CpG島的甲基化修飾[常見的是XbaI，TCTAG(6m)A中的TC無法切開]，一般也是不能用的。但是非要用這個酶切位點的話，就需要用非甲基化的感受態細胞，如JM109或者JM110。

4.第四步，看多克隆位點的序列：

末端如果有差異的話，可以把基因的ATG（甲硫氨酸）的5`末端替換1-2個鹼基（變成GTG或者GCG這樣），從第二個氨基酸序列開始完全一致即可。而配合擴增和酶切的話，插入片段是允許有3`末端的冗餘。

為了可以應付3`末端的冗餘鹼基，在多克隆位點序列後，會有解碼的終止TAA密碼，即使插入的片段使得3`末端產生了移碼突變，照樣能使表達的蛋白正常終止掉（在酵母雙雜的AD質粒中，由於插入的是隨機cDNA，所以AD的載體上會常見這樣的結構）。

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分類

1.根據質粒能否通過細菌的接合作用，可分為接合性質粒和非接合性質粒。

接合性質粒帶有與接合傳遞有關的基因。非接合質粒在一定條件下通過與其共存的接合質粒的誘動或轉導而傳遞。

2.根據質粒在細菌內的復制類型可分為兩類：嚴緊控制型和鬆弛控制型。

嚴緊控制復制型質粒的復制酶系與染色體DNA復制共用，只能在細胞周期的一定階段進行復制，當細胞染色體停止復制時，質粒也就不再復制。

鬆弛控制復制型的質粒的復制酶系不受染色體DNA復制酶系的影響，在整個細胞生長周期中隨時都可以復制，在染色體復制已經停止時質粒仍能繼續復制。

3.根據質粒的不相容性，可分為不相容性和相容性。

不相容性指結構相似、密切相關的質粒不能穩定地共存於同一宿主細菌內的現象，反之為相容性。常用於流行病學的調查。

⑵ trx是什麼意思

trx懸掛訓練;硫氧化還原蛋白;硫氧還蛋白;蛋白;收發信機。

Trx has various biological functions in keeping stable redox status of cells.

硫氧還蛋白具有多種生物學功能，對維持體內穩定的氧化還原狀態具有重要的作用。

Construction of recombinant adenovirus vector with TRX gene by Tet-Off inction.

Tet-Off誘導的硫氧還蛋白基因重組腺病毒載體的構建。

These studies have shown that: TRX can suppress tumor cell apoptosis.

研究表明：TRX可以抑制腫瘤細胞凋亡。

Trx plays crucial roles in regulating cell growth, apoptosis and gene transcription.

Trx具有調節細胞生長、抑制凋亡、調節基因轉錄等功能。

CONCLUSION: TRX protein plays an important role in the defense response of myocardium against oxidative stress.

結論：TRX蛋白在心肌的氧化應激防禦反應中起重要作用。

⑶ 去哪購買比較好點的PGK啟動子的載體

摘要： HAP轉錄因子(HAP2/HAP3/HAP4/HAP5) 是存在於釀酒酵母中的一種異源多聚蛋白，它能與酵母中許多啟動子上游的CCAAT盒（順式作用元件）專一性結合， 以增強基因的轉錄。在酵母hap5突變株的細胞中，用酵母單雜交系統從水稻cDNA-GAL4表達文庫中篩選出的陽性克隆是編碼谷胱甘肽氧還蛋白的cDNA，提示細胞內的氧化還原系統可能作用於HAP蛋白，從而對CCAAT盒的結合活力起調節作用。 對HAP3亞基分子中半胱氨酸殘基的突變實驗結果支持上述推測。
關鍵詞： CCAAT，HAP復合物， 轉錄因子，氧化還原系統

DNA-Binding Activity of the Transcription Factor HAP Is Regulated by Cellular Redox

YAO Quan-Hong, XING Yan-Yan, WANG Zong-Yang, ZHANG Jing-Liu and HONG Meng-Min

Shanghai Institute of Plant Physiology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032

Abstract：The CCAAT binding factor of brewer's yeast Saccharomyces cerevisiae has been shown previously to be a heteromeric complex containing HAP2, HAP3, HAP4 and HAP5 subunits. This factor can bind specifically to CCAAT-containing upstream sites within the promoters of numerous yeast genes, and then activate the transcription. By using a yeast one-hybrid system, we tried to isolate the counterpart of the yeast HAP5 gene from rice cDNA-Gal4 fusion library constructed in a E.coli-yeast shuttle vector pPC86. However, we identified a cDNA encoding glutaredoxin (Fig．1). The results indicte that the cellular redox environment of yeast cell may be a factor regulating the CCAAT-box-binding activity of the HAP3 subunit (Table 1). The results of the HAP3 mutants in which the highly conserved cysteine resies at positions 68 and 72 had been converted to serine support the above suggestion (Table 2).
Key words: CCAAT, HAP complex, transcription factor, redox system

真核基因轉錄起始時，有一些被稱為轉錄因子的核蛋白會結合在真核基因啟動子上游的順式作用元件上，以增強或阻遏真核基因的轉錄(Wolberger 1993)。 有些轉錄因子要經過磷酸化或二聚化，引起蛋白分子的構型發生一些改變後，才具有與DNA結合的能力（Hunter和 Karin 1992）。最近Zheng 等（1998）報告，有些轉錄因子與DNA 的結合活力受細胞中的氧化還原狀態的調節。例如，用凝膠滯後試驗在體外研究Jun和Fos轉錄因子與含Ap-1結合位點的DNA的結合作用時，觀察到硫氧還蛋白(thioredoxin)、還原輔酶Ⅱ(NADPH)與硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin rectase)可明顯提高它們的異源二聚體與DNA的結合能力(Abate等1990)。
在一些真核基因轉錄起始點上游存在核心序列為CCAAT的順式元件，該元件可呈正、反兩種方向(Van Huijsijnen等 1987)。 已知釀酒酵母中至少有16種基因的5』端上游都含CCAAT元件。與這些基因上游的CCAAT結合以調節基因轉錄的反式作用因子是HAP復合物(Pinkham和Keng 1992)， 它是由HAP2、HAP3、HAP4和HAP5 四個蛋白亞基組成的異源多聚體，其中HAP2和HAP3都含有DNA結合域，但單獨的HAP2和HAP3蛋白都不具DNA結合活性，只有當HAP2與HAP3 通過它們的亞基結合域形成二聚體蛋白時才構成一個完整的CCAAT盒結合功能域(Xing 等1993) 。而且體內與體外的研究都證實，這種復合功能域的形成還需要HAP5亞基的參與（McNabb等1995）。HAP4亞基含有活化結構域(activation domain)，起活化基因轉錄的作用(Foraburg和Guarente 1989)。近年來，已從粟酒裂殖酵母、小鼠、大鼠、人等生物中克隆了編碼CCAAT盒結合蛋白的基因， 這些CCAAT結合蛋白與酵母HAP轉錄因子類似蛋白間存在高度同源的結構域(Van Huijsijnen等1990)；在高等植物中， 也已從油菜中克隆了與HAP2亞基中DNA結構域高度同源的基因(Albani和Robert 1995)。
我們曾報告，用釀酒酵母CYC1基因啟動子上游含CCAAT盒的DNA片段為「魚鉺」，在HAP2基因突變的酵母細胞中，用酵母單雜交方法從水稻cDNA-GAL4 表達文庫中篩選出了編碼HAP2類似蛋白的cDNA克隆(姚泉洪等待發表)。本研究用相似的方法，在HAP5突變的酵母細胞中，用酵母單雜交方法， 試圖從水稻cDNA-GAL4 表達文庫中篩選出編碼水稻HAP5類似蛋白的cDNA。但HAP5類似cDNA沒有篩到，卻幾次篩選到水稻中編碼谷胱甘肽氧還蛋白(glutaredoxin)的cDNA。這一意外的結果提示我們HAP轉錄因子與DNA結合受氧化還原（redox）調節的可能性。 本文報告上述實驗結果以及對HAP3亞基中半胱氨酸殘基進行的突變實驗，並就HAP轉錄因子的DNA結合活力是否受氧化還原調節的問題進行了討論。
1 材料與方法
1.1 工具酶與化學試劑 限制性內切酶和其它基因工程工具酶為德國Boeringer公司產品，X-gal購自Sigma公司，其它化學試劑為美國Sigma公司或國產AR級試劑。
1.2 菌種和質粒 MC8為氨基酸缺陷型大腸桿菌菌株(thi－,trp－,ura－,leu－,his－)。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）hap5缺陷型菌株為Δhap5-10 (MATα,leu 2-3,112,ura3-52,his4-519,adel-100,trp1 Δhap5)。大腸桿菌-酵母穿梭載體pLG Δ-265 UP1帶有lacZ報告基因、URA選擇標記、2μ復制序列和酵母CCAAT盒。lacZ報告基因由CYC1的基本啟動子控制，而含CCAAT盒的DNA片段位於CYC1的基本啟動子上游，此元件被轉錄因子結合後，即可調節lacZ基因的表達。釀酒酵母-大腸桿菌穿梭載體pPC86帶有色氨酸合成酶基因，系朱群博士贈送。pDB20(HAP5)質粒帶LEU選擇標記，該載體由ADH1啟動子控制酵母HAP5基因的表達用作鑒定水稻類似HAP5 cDNA時的陽性對照。pYP2質粒由本實驗室構建，它帶有PGK啟動子及色氨酸合成酶基因，PGK啟動子後的BamHⅠ和KpnⅠ切點間插入用於表達的cDNA。
1.3 PCR引物 酵母pPC86載體cDNA插入5'端Gal4激活功能域側的引物為：GAL4(5'-GGATGTTTAATACCACT-3'）,3'端ADH終止子側的引物為：TAD4(5'-TTGATTGGAGACTTGACC-3')。水稻穀胱甘肽氧還蛋白cDNA(Minakichi等1994)兩側的引物分別為：5'端翻譯啟始密碼子ATG附近的引物Gluta1(5'AAGGATCCATGGCGCTCGCCAAGGCCAAG 3'), 3'端翻譯終止密碼子TAG附近的引物Gluta2(5' 3')。釀酒酵母HAP3基因(Hahn等1988)兩側的引物分別為：5'端翻譯起始密碼子ATG附近的引物HAP3Z1(5'AAGGATCCATGAATACCAACGAGTCC 3')，3'端翻譯終止密碼子TGA附近的引物HAP3F1(5'TTGTGGTACCTCAAGGCACCTCTTCG 3')。用於釀酒酵母HAP3基因第68位Cys突變為Ser的內側突變引物分別為：含突變鹼基的5'端引物HAP3Z2(5' CGAAAGAGTCCATGCAGGAG 3')，含突變鹼基的3'端引物HAP3F2(5'CTCCTGCATGGACTCTTTCG 3')。用於釀酒酵母HAP3基因第72位Cys突變為Ser的內側突變引物分別為：含突變鹼基的5'端引物HAP3Z3( 5'CATGCAGGAGTCTGTCAGTG 3') ，含突變鹼基的3'端引物HAP3F3(5'CACTGACAGACTCCTGCATG 3')。
1.4 酵母表達型水稻cDNA庫 構於酵母載體pPC86的水稻IR36幼苗的表達型cDNA庫由美國Salk研究所的朱群博士提供。
1.5 培養基 大腸桿菌MC8生長於添加亮氨酸、尿嘧啶、組氨酸、維生素B1的M9基本培養基， 用於選擇帶有水稻cDNA的pPC86質粒。含2％葡萄糖或2％乳酸的釀酒酵母豐富培養基YPD、基本培養基SC及酵母X-gal培養基的制備參照Sherman（1991）的方法。
1.6 酵母感受態細胞的制備及質粒轉化 釀酒酵母的質粒轉化選用Gietz等(1992)的醋酸鋰法。於30℃過夜培養5 ml釀酒酵母至OD600為0.5左右，擴大培養至50ml,再生長4h後，5000×g離心8min收集細胞。以20ml無菌水洗，然而把離心收集的酵母以10ml新配的LiAc溶液100mmol/L(用pH 8.0的Tris 10mmol/L、 EDTA 0.1mmol/L 緩沖液配製)洗1次。7000×g離心8min後，最終將酵母細胞懸於0.5ml的LiAc溶液中。50μl的酵母懸液中加入 1μg的質粒DNA、50μg的鮭魚精DNA及300μl含40% PEG3350的LiAc溶液，充分混勻後於30℃保溫30min。接著於42℃熱激15min。把離心收集的酵母細胞重懸於TE溶液中，並塗於酵母選擇培養基。
1.7 DNA操作 酵母DNA的快速抽提按Robzyk和Kassir（1992）的方法。DNA操作按標準的分子克隆步驟（Sambrook等1989）。大腸桿菌的電擊轉化按Dower等(1988)的方法。抽提含水稻cDNA陽性質粒的雙鏈DNA，在ABI 377型DNA自動化測序儀上進行序列測定。 引物GAL4與TAD4間的PCR擴增反應條件為：94℃ 40s, 42℃ 50s, 72℃ 3min，共擴增30個循環。水稻穀胱甘肽氧還蛋白cDNA兩側引物Gluta1和Gluta2間的PCR擴增反應條件為：94℃ 30s, 66℃ 45s， 72℃ 30s，共擴增30個循環。酵母HAP3基因的定點突變採用重疊延伸法(Ho等1989)。HAP3外側引物間及外側引物與內側引物突變間的PCR擴增反應條件為：94℃ 30s, 48℃ 40s，72℃ 30s，共擴增30個循環。
2 結果
2.1 酵母單雜交法篩選水稻中類似酵母HAP5基因的cDNA
酵母單雜交體系最初是由Wang和Reed (1993)所設計,它含兩個質粒：其一為酵母表達質粒，用於表達cDNA與GAL4激活功能域的融合蛋白;另一質粒將一個順式作用元件與帶有基本啟動子的細菌lacZ報告基因連接，該載體稱作魚餌質粒。本實驗酵母單雜交體系中所用的魚餌質粒為pLGΔ-265 UP1，該載體是把含CCAAT的順式作用元件插入到178載體中CYC1基本啟動子上游構建而成。我們先將魚餌質粒pLGΔ-265 UP1轉化入酵母菌株Δhap5-10，在不含尿嘧啶的平皿上得到轉化子Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1)。然後將30μg含水稻cDNA的pPC86載體轉化到感受態酵母中，於不含尿嘧啶和色氨酸的培養基上培養。得到3×106左右的轉化子，用硝酸纖維膜將這些轉化子復印至X-gal平板上進行顯色反應。作為陽性對照，含HAP5基因表達載體pDB20(HAP5）及魚餌質粒pLGΔ-265 UP1的Δhap5-10酵母菌株經培養6 h後已顯藍色。而含水稻cDNA庫的質粒pPC86的Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1)酵母菌株2 d後才出現藍色菌落。此實驗重復進行了4次，一共獲45個藍色酵母菌落。
2.2 酵母陽性菌落的重復篩選
為了驗證初篩得到的酵母陽性菌落中是否含有相似於HAP5功能的cDNA克隆，從上述45個酵母陽性菌落中抽提DNA，用電擊法將DNA轉化到大腸桿菌MC8中，培養於2YT+Ap平板，然後復印至不含色氨酸的M9培養基平板上培養。因為pPC86質粒上帶有編碼TRP合成酶的標記基因，因此能生長出的菌落表明它帶有pPC86質粒。然後再從能在不含色氨酸M9培養基上生長的大腸桿菌中抽提質粒DNA，將這些質粒DNA分別轉化到酵母Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1)菌株中，於X-gal平板上進行顯色，從中鑒定出能使酵母菌落重復變藍的cDNA克隆17個。
2.3 陽性克隆的鑒定和測序
由於hap5缺陷型酵母不能在含非發酵性碳源的培養基上生長，我們將4次酵母單雜交篩選並經復篩後留下的17個陽性質粒轉化入Δhap5-10缺陷型酵母進行功能互補法鑒定。結果表明，這些含水稻cDNA的陽性質粒都不能使hap5缺陷型酵母在非發酵性碳源的培養基上生長。它們都沒有補償缺陷型酵母中所缺失的HAP5的功能，因此不是編碼類似HAP5的cDNA克隆。為了弄清它們的結構，我們以GAL4和TAD4為引物進行PCR擴增。並對擴增出的cDNA順序分別進行Sau3AⅠ酶切，根據酶切帶型對各批篩出的cDNA進行歸類。結果表明，17個中有6個篩出的陽性cDNA具類似酶切帶型；4次篩庫中有3次獲得該類cDNA克隆。我們以GAL4和TAD4兩引物直接對具相似酶切帶型、編號為C3的cDNA進行DNA序列分析，圖1的結果顯示其核苷酸與已報道的水稻穀胱甘肽氧還蛋白cDNA序列完全相同(Minakichi等1994)。我們又按照所測出的水稻穀胱甘肽氧還蛋白cDNA的核苷酸順序，合成了cDNA兩端的寡核苷酸引物gluta1和gluta2，並對所獲的6個具相同酶切帶型的cDNA克隆進行PCR擴增，結果也確證它們都是編碼水稻穀胱甘肽氧還蛋白的cDNA。

圖1 水稻C3 cDNA克隆的核苷酸順序及推導的氨基酸序列

Fig.1 Sequence of the C3 cDNA clone and predicted amino acid sequence

2.4 C3所編碼的谷胱甘肽氧還酶對HAP復合物DNA結合活性的影響
以C3的DNA為模板，用兩端分別存在BamHⅠ和KpnⅠ酶切點的gluta1和gluta2為引物進行PCR擴增。將此含glutaredoxin基因完整編碼區的PCR擴增片段經BamHⅠ和KpnⅠ酶切後克隆到酵母表達載體pYP2中PGK啟動子後的相應酶切點間，構成酵母重組質粒pYP3。接著將pYP2、pDB20、pDB20(HAP5)與pYP3等4種質粒分別轉化到已經帶有質粒p178或pLGΔ-265 UP1的兩酵母菌株Δhap5-10(p178)和Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1)中。將上述4種質粒分別轉化兩株酵母菌株。這兩株酵母菌株為hap5突變株，但含有具激活功能的HAP4蛋白，有結合功能的HAP2、HAP3蛋白。在不含尿嘧啶和色氨酸的培養基上得到轉化子，並將這8種酵母轉化子用硝酸纖維素膜分別復印至X-gal平板上進行顯色反應，2 d後轉化子Δhap5-10( pYP3+pLGΔ-265 UP1)顯藍色，陽性對照菌株Δhap5-10(pDB20(HAP5)+pLGΔ-265 UP1)菌落呈深藍色，而陰性對照菌株Δhap5-10(pYP2+pLGΔ-265UP1)和Δhap5-10(pDB20+pLGΔ-265 UP1)以及4種質粒在酵母菌株Δhap5-10(178)中的轉化子都沒有藍色顯現(表1)。說明glutaredoxin能使HAP2、HAP3與HAP4在沒有HAP5的情況下使lacZ基因得到表達。

表1 C3所編碼的glutaredoxin對魚餌質粒上lacZ基因表達的影響

Table 1 Effects of glutaredoxin encoded by C3 on the lacZ gene expression in t plasmid

Plasmid Expression of lacZ gene
p178 pLGΔ-265 UP1
pYP2 － －
pDB20 － －
pDB20(HAP5) － +++
pYP3 － +

2.5 HAP3蛋白Cys位點突變對HAP復合物DNA結合活性的影響
在hap5缺失型酵母細胞中，glutaredoxin能使HAP2、HAP3與HAP4一起使lacZ表達。由於已知glutaredoxin是參與調節細胞氧化還原狀態（redox）的主要成分，因此我們推測它對HAP蛋白的作用可能是調節HAP蛋白中－SH與－S－S的可逆反應。為弄清它是否起這種作用，我們將HAP3基因第68位及第72位Cys突變為Ser，來驗證此種推測是否正確。方法是以Δhap5-10菌株DNA為模板，分別以HAP3Z1、HAP3F2及HAP3Z2、HAP3F1這兩對引物進行PCR擴增。再以回收的兩個PCR產物為模板，通過HAP3Z1和HAP3F1引物擴增出第68位Cys突變為Ser的HAP3基因。並以同樣的方法獲得第72位Cys突變為Ser的HAP3基因。分別將HAP3基因及兩突變基因的BamHⅠ和KpnⅠ酶切產物克隆入pYP2酵母表達載體，構成帶有HAP3基因的質粒pYP4、帶有第68位Cys突變為Ser的HAP3基因的質粒pYP5及第72位Cys突變為Ser的HAP3基因的質粒pYP6。接著把pYP4、pYP5和pYP6質粒分別轉化入含質粒p178和pLGΔ-265 UP1的酵母Δhap5-10菌株中，在不含尿嘧啶和色氨酸的培養基上選擇酵母轉化子。轉化子用硝酸纖維膜復印至X-gal平板上進行顯色反應，2 d後兩種帶有HAP3發生突變基因的質粒的轉化子在沒有glutaredoxin存在的情況下都顯示出藍色。而帶有正常HAP3基因質粒的轉化子沒有顯示藍色，且轉化到Δhap5-10(178)菌株中的4種轉化子也沒有顯示藍色(表2)。該結果說明在hap5基因突變酵母細胞中，－SH被突變後的HAP3亞基與細胞中的HAP2、HAP4，即能在單雜交系統中使lacZ基因組成性地表達，而無需glutaredoxin的氧還調節。
表2 HAP3蛋白Cys位點突變對魚餌質粒上lacZ基因表達的影響

Table 2 Effects of mutant HAP3 at cysteine resies on the lacZ gene expression in t plasmid

Plasmid Expression of lacZ gene
p178 pLGΔ-265 UP1

pYP2 － －
pYP4 － －
pYP5 － +
pYP6 － +

3 討論
細胞中存在多個調節細胞氧化還原(redox)狀態的系統，其中之一為谷胱甘肽氧還蛋白系統，此系統包含谷胱甘肽、谷胱甘肽還原酶與谷胱甘肽氧還蛋白(Holmgren 1989)。該系統通過谷胱甘肽氧還蛋白中半胱氨酸殘基上的－SH氧化成－S－S－鍵或可逆地還原成－SH來調節細胞中的redox狀態。這種redox狀態也促使某些功能性蛋白分子上的－SH或－S－S－隨即發生可逆的氧化或還原，並引起蛋白分子的構型改變，從而影響蛋白分子的活性、穩定性與正確的折疊等重要功能(Holmgren 1989)。
我們在HAP2酵母突變株細胞中，用酵母單雜交方法從水稻cDNA-GAL4 表達文庫中成功地篩選到水稻中與HAP2類似的基因RAPB，且RAPB基因可互補酵母的hap2缺陷。這表明用此套單雜交系統來篩選轉錄因子基因是有效的。按推理，用相同的酵母單雜交系統，在酵母hap5突變株細胞中也應能篩選到水稻的HAP5類似基因，但是所得到的陽性cDNA克隆都不能互補酵母HAP5的缺陷性狀。對所得到的陽性cDNA克隆進行核苷酸順序分析的結果表明，從水稻cDNA文庫中得到的這些cDNA所編碼的是谷胱甘肽氧還蛋白，而不是期望的水稻編碼類似酵母HAP5蛋白。Minakichi等(1994)曾報告水稻glutaredoxin基因的表達主要集中於種子中，而在葉片中的表達很低。而4次篩水稻葉片表達型庫過程中有3次篩到glutaredoxin基因，這說明這一實驗結果並非偶然。至於為何未篩到HAP5類似基因，是由於我們所用的水稻cDNA-GAL4表達文庫中沒有HAP5-cDNA，還是由於水稻中沒有類似此功能的基因，這還有待進一步研究。
酵母功能互補試驗顯示水稻glutaredoxin基因沒有明顯的互補HAP5基因的活性；酵母單雜交試驗的結果也說明水稻glutaredoxin基因增強lacZ基因表達的活性遠低於HAP5基因。有人推測酵母HAP5蛋白的功能可能是與HAP2和HAP3兩亞基間發生疏水相互作用，從而促使形成一種穩定的能結合CCAAT盒的復合結構(McNabb等1995)。如果這種推測是正確的話，那麼glutaredoxin的作用也可能是使HAP3亞基保持－SH基狀態，從而使HAP2和HAP3之間形成一種不穩定的與CCAAT盒結合較弱的復合結構。glutaredoxin對HAP復合物DNA結合活性的促進及HAP3亞基中半胱氨酸殘基突變成絲氨酸殘基實驗的結果與上述推測較相符。即第68和72位Cys突變為Ser的HAP3蛋白和HAP2蛋白相互作用即具有CCAAT盒結合活性。
到目前為止，已經報告過許多轉錄因子，如c-fos和c-jun(Abate等1990)，NFκB/Rel(Matthews等 1992)，c-Myb(Guehmann等1992)，BPV-1(McBride等1992)，USF(Pognonec等1992)和NF-Y(Nakshatri等1996)等的DNA 結合活力均受redox調節。其中NF-Y是從人與小鼠細胞中克隆出的能與CCAAT盒結合的轉錄因子， 它也是異源多聚體蛋白。NF-YA、NF-YB分別為釀酒酵母的HAP2、HAP3的類似基因，兩者中有高度同源的結構域，且功能上可互換(Maity等1992, Kim等1996，Coustry等1995)。另外至今所發表的HAP3類似蛋白中3個半胱氨酸殘基的位置是保守的(Xing等1993)。
Nakshatri等(1996)報告小鼠的NF-Y轉錄因子與CCAAT盒在體外的結合活力受redox 狀態的調節。硫氧還蛋白可以增強NF-Y異源多聚蛋白與CCAAT盒結合的活力，當－SH基被烷化後NF-Y與CCAAT的結合活性受到破壞。通過將蛋白分子的半胱氨酸殘基逐個突變去除，證明受調節的是NF-YB亞基中的第85位與89位上的兩個半胱氨酸，已知硫氧還蛋白與谷胱甘肽氧還蛋白一樣，也是細胞中一種氧化還原調節系統， 因此我們報告的glutaredoxin在沒有HAP5的情況下能使HAP2 與HAP3 結合在CCAAT盒上的發現，與他們的結果特別是硫氧還蛋白對NF-Y蛋白與CCAAT盒結合活性的調節作用可以互為佐證，並對進一步了解HAP5(NF-YC)亞基的功能有重要的意義。

國家自然科學基金(39893320)資助項目。

作者單位：中國科學院上海植物生理研究所，上海 200032

⑷ 蛋白的表達與純化

蛋白表達純化已經是非常經典簡單的實驗了，沒有LSS說的那麼嚇人。
說說我的蛋白表達純化以及下面的單抗製作工作總體設計概要吧：

1 首先要知道你要純化蛋白的編碼DNA序列，查閱相關文獻，看目的基因在那些細胞或者組織中高表達，進而設計該基因的引物，擴增出目的DNA片段的ARF。這一布叫目的基因片段的獲取

2 構建表達載體：根據你獲得的基因本身的特性確定原核或者真核載體中表達，這一步的主要問題就是構建帶有目的基因的質粒，導入表達系統中。一般原核表達時間短，成本低，表達量大，常優先考慮；但是有些基因在E coli中就是表達不出，可能是密碼子優化等出現問題，也或者是由於想純化得到更好的活性蛋白的考慮（原核的蛋白折疊系統顯然沒有真核的好），有很多研究者選擇在畢赤酵母中表達。（我手裡就有相關資料，因為以前做過表達純化及後來的單抗制備），這一步再強調一下，優化密碼子對於蛋白的成功表達很重要

3 載體構建好了，下面就是重組蛋白的表達了。這一過程涉及到用多少的誘導劑，誘導多少時間才能得到最多的蛋白的問題，即優化表達條件。就是在上述不同量誘導劑誘導條件下，取菌體上清（分泌型）或者破碎細胞（胞內表達的蛋白）電泳，看是否得到目的分子量大小的蛋白

4 蛋白表達成功，下面是根據蛋白質本身親水/疏水，電荷帶電特性等確定蛋白純化的方法。一般步驟：離心，取蛋白所在的相
如果是分泌表達的蛋白，則取上清，超濾，沒有超濾儀器可以用透析袋等代替，用離子交換柱層析。基本上這一步能得到純化的95％的蛋白，電泳鑒定基本不會看到有雜帶出現。如果還是純度不符合要求，可以在表達蛋白最初在構建表達載體質粒的時候在蛋白的ORF後面加上HIS－標簽，這樣得到的蛋白不但可以用於HIS柱的進一步純化，在不確定自己的融合蛋白是否有表達的時候，也可以單單用抗HIS的抗體做一WB，分析確認目的蛋白是否表達，這是蛋白表達的常用手段。

5 經過純化後的蛋白仍然含有一部分無機鹽，如果需要的話可以將蛋白經真空凍干機凍干，得到純蛋白。

我們實驗室做出來的一個蛋白，編碼序列GC含量高75達％，但是功夫不負有心人，只要你想做那件事情，積極的尋找解決問題的手段，總會搞定的，沒有跨不過的坎。如果坎太寬，搭橋解決總行。

⑸ 內源性活性物質的葯用價值

內源性活性物質，所謂內源性，就是指身體內含有，與人的生存和健康息息相關，尤其對皮膚抗衰老有巨大貢獻。它們攝入不足，就會削減皮膚的免疫、抗損傷能力，造成皮膚衰老。目前，內源性活性物質已廣泛運用於美白、保濕以及抗衰老等功效型化妝品中。以具有抗衰老功效的化妝品為例，此類護膚品中多數都含有維生素C、E，神經醯胺，透明質酸，超氧化物歧化酶SOD等天然內源性物質。隨著分子生物學和生物化學的不斷發展，越來越多的內源性生物活性物質會展現其葯用價值。
以下列舉幾種具有抗衰老作用的內源性活性物質：
（1）乙醯化六肽（祛皺肽）
抗衰老原理：曾經有生物學家說過，補肽就等於補生命，可見肽對於抗衰老的重要性。祛皺肽，學名又叫乙醯化六肽，類肉毒素成分，它有肉毒素的功能，但沒有肉毒素的毒性。阻斷肌肉神經傳遞速度，從而抑製表情紋及細小皺紋的產生多肽通常由10-100氨基酸分子脫水縮合而成的化合物。多肽是人體重要的生理調節物，它可全面調節人體生理功能，有效抗擊衰老。
（2）維生素C
抗衰老原理：提起維生素C，相信沒有人會陌生。它是水溶性物質，能夠重建真皮表皮結合部，促進膠原纖維生成。此外還具有很強的清除自由基能力，同時也是增強身體免疫力不可缺少的成分。研究證明，經常補充維生素C的人比普通人的壽命更長，它富含於瓜果蔬菜當中，胡蘿卜、西紅柿和柑橘類水果中都含有豐富的維C。
（3）二勝肽 抗衰老原理：勝肽最近一直是化妝品科研領域最熱門的話題，因為勝肽成分先進，效果顯著，被很多葯妝品牌使用。但是勝肽的價格很貴，所以添加了勝肽的產品也賣的比較貴。一般來說，勝肽能促進膠原蛋白，彈力纖維和透明質酸增生，提高肌膚的含水量，增加皮膚厚度以及減少細紋。繼之前的五勝肽與六勝肽大熱之後，最近二勝肽也被廣泛的應用在了抗衰老的護膚品中。
（4）透明質酸
抗衰老原理：它是透明的人體天然保濕成分，可以持久保濕，促進其他活性成分的吸收，為真皮膠原蛋白和彈性纖維的合成提供良好的環境，減輕老化皺紋痕跡。
(5）維生素E
抗衰老原理：它是被研究和應用最多的抗老成分之一，屬於人體主要的脂溶性抗氧化物，可以清除體內自由基以阻斷氧化反應的生成，並減輕和修復細胞膜損傷，達到抵抗衰老的作用。由於細胞中只含有極少量的維生素E，且人體自身無法合成，所以只能從外來補充物中獲得，未精製的植物油、杏仁、堅果油等都含有較多的維生素E。
（6）SOD
SOD是Super Oxide Dimutese縮寫，中文名稱超氧化物歧化酶，是生物體內重要的抗氧化酶，廣泛分布於各種生物體內，如動物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內清除自由基的首要物質。SOD在生物體內的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標；現已證實，由氧自由基引發的疾病多達60多種。它可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，並及時修復受損細胞，復原因自由基造成的對細胞傷害。由於現代生活壓力，環境污染，各種輻射和超量運動都會造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化機制中SOD的地位越來越重要！
（7）蛋氨酸亞碸還原酶A（MsrA）蛋氨酸亞碸還原酶A是繼超氧化物歧化酶之後的另一種引起自由基醫學界和老年醫學界廣泛關注的抗氧化酶。與超氧化物歧化酶相比，它不僅可以在細胞內發揮清除氧化因素的作用，還可以對已經發生蛋白質氧化進行有效修復，增加它的水平和活性可以延長多種生物的壽命。蛋氨酸亞碸還原酶A的表達在多種衰老組織中顯著下降。
蛋氨酸亞碸還原酶A（MsrA）是目前發現的可在生物體內還原逆轉蛋白質蛋氨酸殘基氧化結構變化和功能損傷的主要抗氧化酶系統。硫氧還原蛋白（Trx）是一種低分子量、進化上高度保守的有還原二硫鍵氧化產物活性的蛋白質，主要功能是調節細胞胞內氧化還原平衡，參與氧應激誘導的細胞凋亡。它既是MsrA系統在體內發揮功能最重要的伴侶分子，同時也是還原體內半胱氨酸殘基氧化最重要的功能分子。
最新研究表明，華中科技大學曾建華博士等人利用基因工程技術開發的 ，可以進入細胞顯著減少氧化應激引起的細胞損傷，清除氧自由基並降低氧化應激引起的蛋白質氧化水平，減少衰老過程中脂質過氧化引起的細胞損傷，緩解衰老過程中脂質過氧化引起的病理變化。
總之，我國未來葯物、葯妝品發展應抓住機遇，面向未來，充分利用人類基因組及蛋白質組計劃提供的信息，注意開發能控制人類疾病的內源性活性物質作為治療葯物。21世紀，人類的基因組和蛋白質組資料一定會成為新葯開發和發展的重要基礎。許多生物技術公司和制葯公司已開始意識到未來在使用這些信息方面有著巨大的潛力，我國亦應充分給予重視，並給予較大投入。

⑹ 簡述檢測還原糖、蛋白質所用試劑的名稱、配方，使用方法和實驗現象

還原性糖 ： 斐林試劑； 是由氫氧化鈉的質量分數為0.1 g/mL的溶液和硫酸銅的質量分數為0.05 g/mL的溶液配製而成的； 斐林試劑使用時，先將兩者等體積溶液混和， 而後立即使用在加熱的條件下，能夠生成磚紅色的氧化銅沉澱。 蛋白質： 雙縮脲試劑； 是是由氫氧化鈉的質量分數為0.1 g/mL的溶液和硫酸銅的質量分數為0.01 g/mL的溶液配製而成的； 雙縮脲試劑使用時，先加適量氫氧化鈉的質量分數為0.1 g/mL的溶液，充分振盪，然後加3-4滴硫酸銅的質量分數為0.01 g/mL的溶液； 振盪搖勻，溶液顏色為為紫色。

⑺ 氧化應激的生物標志物

評價方法
氧化應激的定量評價方法大致分做三類：1）測定由活性氧修飾的化合物；2）測定活性氧消除系統酶和抗氧化物質的量；3）測定含有轉錄因子的氧化應激指示物。進一步尚有：1）生物體內氧化應激的程度足以產生應答；2）活體內難以蓄積；3）在活體內不是被代謝，而是穩定存在，等等。理解這些要點對於臨床普及推廣都很有用。
但在臨床上，氧化應激的定量仍舊存在問題。因氧化應激與各種各樣疾病均密切相關，故缺乏特異性，其量化指標難以用於特別指定的疾病。所以目前認為，當用於「全身評價」，或者在已經明確疾病原因為氧化應激後的「嚴重程度及予後」的評價。具有代表性的生物標志物：
8-羥化脫氧鳥苷（8-OHdG)
8-OHdG是敏感的DNA損害標志物，因一個氫氧基接在鳥嘌呤的第8個碳上而形成。不過，其氧化「系由氧化應激所產生的羥自由基誘導」這一點，則為1984年葛西首次報道。8-OHdG由高效液相色譜分離後，容易為電化學方法檢測出，故許多研究室都能進行測定。另外，已於上世紀90年代研製出8-OHdG的特異性單克隆抗體，此後相關論文顯著增加；不但用於理解各種疾病，尚以作為預防醫學健康指標的價值更加受到重視。進一步，近年已使用諸多抗氧化物質進行臨床干預實驗，期待著通過減少8-OHdG，來達到抗衰老和預防疾病目的。
目前報道，可導致8-OHdG上升的疾病就有：慢性病毒性肝炎，系統性紅斑狼瘡，大腸癌以及幽門螺桿菌感染引起的胃炎等。進一步尚了解到，生活方式亦可使8-OHdG增加，比如吸煙飲酒、劇烈運動、進食過飽和紫外線/放射線的暴露等：人們正在探尋，應該採用怎樣的生活方式來控制8-OHdG的水平，形成生活指南，維系個體的健康。
硫氧還原蛋白（TRX）
TRX為細胞內重要的氧化還原調節分子之一；遇有病毒感染、紫外線和環境污染物等各種刺激時，將誘導其細胞內表達。即使TRX單獨存在也可表現出對單態氧和羥自由基的消除作用，除可作為抗氧化劑使用之外，還用做還原蛋白的二硫鍵。進一步，就突觸傳遞， TRX能夠抑制ASK1和p38MAPK的活化。再者，認識到TRX也同樣向細胞外釋放，顯示其細胞因子/趨化因子樣作用。有報告指出，在與人類疾病的相互關系方面，HⅣ感染者和丙型肝炎患者的血清中，可出現TRX濃度的上升。此外尚注意到，對包括風濕性關節炎在內的自身免疫性疾病、缺血再灌注損傷以及慢性心功能不全之類可導致氧化應激的疾病，亦均可應用TRX做有效評價。TRX已有檢測試劑盒。
氧化應激導致的疾病
⒈糖尿病
看法一：胰島素抵抗源於氧化應激 高游離脂肪酸（FFA）刺激的後果是高活性反應分子 性氧簇（ROS）和活性氮簇（RNS）生成增多，從而啟動了氧化應激機制（高活性反應分子產生和抗氧化作用之間長期失衡而引起組織損傷）。這些活性分子可直接氧化和損傷DNA、蛋白質、脂類，還可作為功能性分子信號，激活細胞內多種應激敏感信號通路，這些信號通路與胰島素抵抗和β細胞功能受損密切相關。
看法二：氧化應激損傷胰島β細胞
β細胞也是氧化應激的重要靶點 β 細胞內抗氧化酶水平較低，故對ROS較為敏感。ROS可直接損傷胰島β細胞，促進β細胞凋亡，還可通過影響胰島素信號轉導通路間接抑制β細胞功能。β細胞受損，胰島素分泌水平降低、分泌高峰延遲，血糖波動加劇，因而難以控制餐後血糖的迅速上升，對細胞造成更為顯著的損害。
2004年Ceriello教授提出共同土壤學說，即氧化應激是IR、糖尿病和心血管疾病的共同發病基礎，04年是學說，09年已經成為了不爭的事實。
看法三：氧化應激加速動脈粥樣硬化 低密度脂蛋白（LDL）在動脈內膜的沉積是動脈粥樣硬化（AS）始動因素在血管細胞分泌的ROS作用下，「原始」LDL成為氧化型LDL(ox-LDL），刺激內皮細胞分泌多種炎性因子,誘導單核細胞黏附、遷移進入動脈內膜，轉化成巨噬細胞。ox-LDL還能誘導巨噬細胞表達清道夫受體，促進其攝取脂蛋白形成泡沫細胞。同時，ox-LDL是NADPH氧化酶激活物，能增強其活性、促進ROS產生，也更有利於LDL氧化為ox-LDL。另外，ox-LDL能抑制NO產生及其生物學活性，使血管舒張功能異常

⑻ 大鼠淋巴細胞流試抗體試劑盒哪裡買有鏈接嗎給一個

YYu-ELISA-55414大鼠硫氧化還原蛋白(Trx)ELISA試劑盒，Englishname：TrxELISAKit

YYu-ELISA-55415大鼠硫氧還蛋白還原酶(TrxR)ELISA試劑盒，Englishname：TrxRELISAKit

YYu-ELISA-55416大鼠硫酸褪黑色素(MS)ELISA試劑盒，Englishname：MSELISAKit

YYu-ELISA-55417大鼠硫酸角質素(KS)ELISA試劑盒，Englishname：KSELISAKit

YYu-ELISA-55418兔胱抑素F(CST7)ELISA試劑盒，Englishname：Cystatin-F,CST7ELISAkit

YYu-ELISA-55419兔胱抑素B(CSTB/CST6/STFB)ELISA試劑盒，Englishname：Cystatin-B,CSTB/CST6/STFBELISAkit

YYu-ELISA-55420兔胱抑素A(CSTA/STF1/STFA)ELISA試劑盒，Englishname：Cystatin-A,CSTA/STF1/STFAELISAkit

YYu-ELISA-55421兔胱天蛋白酶8(Casp-8)ELISA試劑盒，Englishname：Caspase8,Casp-8ELISAKit

YYu-ELISA-55422兔胱天蛋白酶-5(CASP5)ELISA試劑盒，Englishname：CASP5ELISAKit

YYu-ELISA-55423兔胱天蛋白酶10(CASP10)ELISA試劑盒，Englishname：CASP10ELISAKit

YYu-ELISA-55424兔胱天蛋白酶1(Casp-1)ELISA試劑盒，Englishname：Caspase1,Casp-1ELISAKit

YYu-ELISA-55425兔胱硫醚β-合酶(CBS)ELISA試劑盒，Englishname：cystathionineβ-synthase,CBSELISAKit等