ethpia

㈠ 暗黑破坏神怎么玩

有些bug可以利用起来，我们把它们作为技巧使用；有些bug则需要尽量避免。

1. bug mf
这个就不用多说了吧。简单说就是，关底的五大boss有两个TC，角色完成任务的时候杀掉该boss是任务杀，掉落物品最低亮金品质，并且不会掉落消耗品。bug mf就是通过建立bug游戏使得没有完成该任务的角色可以无法完成该任务并反复享受任务杀，掉率较高。详见——bug mf详细解说

2. 无形防具升级bug
1.10的bug，1.11已经得到修正。eth的暗金防具使用升级公式升级之后，原有的eth物品50%防御加成丢失。所以大家的无形虫壳，无形wmj，无形ire之类的不要再升级了。

3.聚气bug
1.10bug，1.11已经修正。从1.10版本开始，人物的各个技能之间有了加成。加成只有实际投入的技能点才能提供，装备所带的技能无效。但是，聚气bug除外。当装备了某个带有聚气的装备，并且不加该技能，也不要从装备上获得该技能，自身的技能就可以获得该聚气技能提供的加成。典型的例子就是著名的bug鞋，33级骨牢聚气使得骨系伤害力大大提高。还有腐肉之风戒指，21级的猛毒花藤可以加成狂犬病，便有了暴力毒狼的练法。

4.str/dex bug
str=力量，dex=敏捷。一般以力量bug使用较多。玩家不满足该物品需求的力量 比如wmd需求156, 如果这时候玩家使用一件加力量的装备满足需求 比如用一个+20力量的戒指 在拿上wmd以后再取下戒指, 理论上是无法继续用wmd的 ， 但实际上却有可能用的了，因为wmd上加的30力量正好满足了自己的要求,这就是所谓的STR BUG.
资料馆BB补充：str bug可以在pet上使用，但使用str bug后，该装备显示为正常使用状态，不过其防御,抗性等皆会失效，表现为佣兵挂得特快。
慎用。小心被该bug暴尸。

5.ed/max(min) bug
ed/max jew镶在防具上，ed只对最终最小伤害起作用，max对最终最大伤害起作用
ed/min jew镶在防具上，ed只对最终最大伤害起作用，min对最终最小伤害起作用
一件防具上ed/max JEW出了bug,不影响另一件防具上的ed jew
防具本身上的ED不受影响(即只有ED/MAX OR MIN JEW部分的ED被去掉而已).
RARE JEW,同时具有ED MIN MAX的.ED部分完全无效,起作用的仅仅是MIN MAX部分
简单来说，ed(增强伤害)属性和max/min(最大伤害/最小伤害)属性同时存在在一颗珠子上，该珠子就不要再往防具上镶了。

6.药水bug
毒抗太低？去阿卡拉那里灌上10瓶黑瓶看看。毒抗变成85了吧？喝上几瓶解毒水，可以在短时间内提高10的PR上限。类似的还有溶解瓶，可以提高cr。

7.charge bug
charge=冲锋，pal的常用技能。进行连续冲锋时有时会停在原地动不了，原因可能是连续charge造成法力不够，或者charge没有停下来的时候发动其他攻击。可以按w切换武器解决。
还有一种情况是charge完之后无法再用charge，原因可能是——charge过程中遭受攻击造成强制格挡；charge过程中被攻击死亡；charge过程中pet死亡；charge过程中圣盾时间到。只能重新进游戏解决。

8.安亚bug
角色在pvp被杀后救安亚所得30抗性消失，只能靠重新进游戏解决。

9.sum bug
有大批召唤物的情况下tp，召唤物与自身重合，远程攻击不会对自己造成伤害。最实惠的当属nec和dru了。

10.ama充能一击bug
此bug单机无效。使用一定技巧，ama的充能一击可以成为远程攻击，威力同近身相同。熟练应用此bug可以在进入世界之石大殿原地不动15秒k死巴尔……

11.回城bug
身上带上一本回城/辨识书，然后把盒子放在箱子里，把书放在盒子里，存储离开游戏。下次进入游戏的时候可以在身上没有书的情况下回城/辨识，消耗的是盒子里的书。但是如果你打开了盒子bug就消失了。

12.set bug
装备一套绿色装备会获得该套装的奖励加成。此时冲到怪堆里挂掉并复活，套装奖励仍然存在。

13.ww bug
D2常见bug(申请加个精)
ww=旋风，野蛮人的技能。
要形成ww BUG，必须
一、LOCK 对方NAME不松手；
二、和对方有一定距离，这也是WW BUG得操作过程。
在LocK期间，一定时间后（当你听不到WW的呼呼声），这时，你的WW会和CHARGE一样造成BUG，也就是你得真实坐标不是你和对手在地图上所看到的位置，往往看起来是WW离你很远地转过来，但下1秒对方已经挂了，因为WW其实已经到了对手身边，而对手浑然不觉而已（你自己也不大知道 --#）
ww bug的优点是LOCK可以跟踪对手（此时WW可以非直线性进攻），只消耗1次WW发动所需MANA。缺点是要有一定的启动距离，并且有可能被障碍物打断。

14.nec不死bug
nec穿tgo一套，副手同样装备套装盾。出去冲到怪堆里，连续按w换手直到被杀死。如果运气好，bug成功，在死的地方会站起一个吸血鬼。这时按esc复活，不要去捡尸体，就成不死之身了。还可以穿其它装备。
不过这个bug很难成功。大家不要用这个bug去做坏事啊，被封了不要找我。

15.双光环bug pet
就是双梦或双飞龙，1.10的BUG，1.11已经修正

16.城内pk bug（这个比较无耻，大家还是不要学了）
在城内点敌对，站在城镇门口在城外对方身边召唤某召唤生物，比如石魔，女武神，熊，影子等等，可以单方面虐待对方。
还有就是asn的城内杀人bug，把自己在某地方卡住，然后右键技能选择影子大师，点对方的名字，这时应该是过去交易的，但如果asn被卡住过不去，影子就会追杀对方。

17.eth打孔bug（这个是1.11的新增bug）
没有附加属性的……0ed、0nj的eth普通防具（超强的防具无法用公式打孔）采用公式打孔后，防御力会额外增加50%，而天生的最高ED才15％。

18.1.10nec的某bug(arnold789补充)
就是骨矛和骨魂在射程尽头外形会消失，但伤害实际存在

19.ama的三躲bug(资料馆BB补充)
当ama学会三躲中任意一个后，在使用不可中断的技能(例:炮轰/击退)时一旦三躲被发动，则该不可中断的技能会失效，表现为继续攻击但敌人不掉血。

20.野蛮人不死bug
装备火焰号叫这把剑获得地狱之火技能，先放在左键施展，再放在右键施展，然后在施展地狱火的时候跳跃，将会变为不死（不能移动）。
资料馆BB补充，冰霜之风这把剑可以提供极地风暴技能，同样有这个bug。ww也可以。

21.不死的跳跳虫
在act2，act4和act5均有出现的跳跳虫(沙漠跳跃者等)有时会出现打不死的现象。现在尚未确认bug的形成到底需要什么条件，有人认为是需要用冰火法术轮流攻击。在act2和act4均有这样的情况发生。act5尚未有此类报道。

㈡ 美国有甚么航空航天一类的公司

波音 历来是负责民用机的研制 从90年代处收购了麦,道开始转向军机也生产 但都是研制些比较失败的型号
洛马是美国军机业的龙头老大
诺思罗普-格鲁曼 也是军机市场上不可小瞧的一家公司 但因为B-2项目 导致诺思罗普-格鲁曼现在不再生产军机 主要生产一些其他产品 以战斗机附属产品为主 比方战斗机雷达
所以美国本土现在形成两大巨头
波音 民航业 正在开发的产品 787 7E7
洛马 正在发展的F-35
楼上说的雷神好象是负责导弹吧 不生产飞机

㈢ “对不起” 用世界各国语言怎么说

1、英语English: Sorry

2、日耳曼语Dutch: Droevig

3、法语French: Désolé

4、德语German: Traurig

5、希腊语Greek: Θλιβερ?ς

6、意大利语Italian: Spiacente

7、韩语Korean: mi ahn hae

8、葡萄牙语Portuguese (Brazilian): Pesaroso

9、俄罗斯语Russian: Огорченно

10、西班牙语Spanish: Apesambrado

11、日语Janpanese: ごめんなさい

12、泰文：ขอโทษ

13、印尼文／马来文：minta maaf/mohon maaf

14、丹麦语：Danish: Undskyld!

15、菲律宾：Filipino - nagdaramdam

(3)ethpia扩展阅读：

各国的我想你表示

英语：I miss you

韩语：보고싶다

日语：私はあなたを思って

法语：Je pense que vous

泰语：ฉันต้องการให้คุณ

德语：Ich Will, dass

意大利语：Voglio che tu

俄语：Я думаю, ты

葡萄牙语：EU Quero você

希腊语：σας χάνω

西班牙语：le falto

荷兰语：Ik mis je

加利西亚语：Sinto saudades de ti

泰罗尼亚语：Et trobo a faltar

捷克语：Chybí mi

克罗地亚语：Nedostaje mi

拉脱维亚语：Man tevis pietrūkst

㈣ 世界上有那些植物

世界上的植物很多，有人说会超过35万种，但真正定名的可能还不到10万种。

动植物的分类有个系统，叫“门纲目科属种”，植物称为“界”，植物界，共分为四个“门”，即苔藓植物门，蕨类植物门，裸子植物门，被子植物门。植物是在不断进化的，有的灭绝，有的产生。这四类植物，以被子植物最高级，种类也最多，现在已经划分的植物“科”，已经有几百个，有的科内，就有上万个种已经定名，最著名的就是菊科和禾本科等。

㈤ 求英文高手解题

1,D
根据第一段的第二句话“nothing about people---not their clothes, ideas, or languages—has changed as much as what they eat”，可以知道服装，思想或者是语言的变化都没有食物来的大，所以是D，food
2，C
这题考的是代词，考代词的话，你只要往句子前面找就好了，前一句是“In London, shops where chocolate drinks were served became important meeting places.”主语是shop，所以答案很容易就选出来了
3，D
这题是细节判断题，根据这段“Ireland became so dependent on it that thousands of Irish people starved when the crop failed ring the “Potato Famine(饥荒)”of 1845—1846, and thousands more were forced to leave their homeland and move to America.”人们对于土豆的依赖性很高，把它作为主食，但并不是只吃土豆，因为依赖性高，所以导致当土豆收成不好的时候，很多人就饿肚子了。（这题可以把土豆换成我们的主食大米来类比下）
4，C
细节题，文章中有句“Brazil is now the world’s largest grower of coffee”
5，A
细节题，文章中倒数第二段，有句“and coffee is an important crop in Colombia and other South American countries. But it is native to Ethiopia”可以知道，它应该是native to ethipopia

㈥ 世界上有多少种植物

据估计目前世界上大约有350000种植物。

植物有明显的细胞壁和细胞核，其细胞壁由葡萄糖聚合物——纤维素构成。植物具有光合作用的能力——就是说它可以借助光能及动物体内所不具备的叶绿素，利用水、矿物质和二氧化碳生产食物。释放氧气后，剩下葡萄糖——含有丰富能量的物质，作为植物细胞的组成部分。亚里斯多德将生物区分成植物（通常是不移动的）和动物（时常会移动去获取食物）两种。在林奈系统里，则被分为了植 物界和动物界两界。

后来，人们渐渐了解过原本定义的植物界中包含了数个不相关的类群，并将真菌和数种藻类移至新的界去。然而，对于植物仍然有许多种看法，不论是在专业上的，还是在一般大众的眼中来看。而也确实，若试图要完美地将“植物”放至单一个分类里是会发生问题的，因为对于大多数的人而言，“植物”这一词对现今分类学和系统分类学所立基的种系发生学的概念之间的关连性并不是很清楚,繁殖方法主要有压条、分株、扦插、嫁接、种子、孢子等。

生命的起源是由化学物质构成的DNA和原生浆液。植物伊始距今二十五亿年前（元古代），地球史上最早出现的植物属于菌类和藻类，其后藻类一度非常繁盛。直到四亿三千八百万年前（志留纪），绿藻摆脱了水域环境的束缚，首次登陆大地，进化为裸蕨类植物和蕨类植物。为大地首次添上绿装。

(6)ethpia扩展阅读：

植物组成器官

组成器官

植物共有六大器官：根、茎、叶、花、果实、种子。茎是植物体中轴部分。直立或匍匐于水中，茎上生有分枝，分枝顶端具有分生细胞，进行顶端生长。茎一般分化成短的节和长的节间两部分。茎具有输导营养物质和水分以及支持叶、花和果实在一定空间的作用。有的茎还具有光合作用、贮藏营养物质和繁殖的功能。

叶是维管植物营养器官之一。功能为进行光合作用合成有机物，并有蒸腾作用提供根系从外界吸收水和矿质营养的动力。花是具有繁殖功能的变态短枝。果实主要是作为传播种子的媒介。种子具有繁殖和传播的作用，种子还有种种适于传播或抵抗不良条件的结构，为植物的种族延续创造了良好的条件。

根

根是植物的营养器官，通常位于地表下面，负责吸收土壤里面的水分及溶解其中的离子，并且具有支持、贮存合成有机物质的作用。（气生根和固着根除外）根由薄壁组织、维管组织、保护组织、机械组织和分生组织细胞组成。

茎

茎是植物的营养器官之一。是大多数植物可见的主干。当然，例如仙人掌的变态茎。茎下接根，通过木质部将根部吸收到的水分和矿物质往上运输到各营养器官，通过韧皮部将光合作用的产物往下运输。茎来源于植物胚胎的胚芽。胚轴组成部分的茎，准确地说是子叶下的部分。

叶

叶是高等植物的营养器官，侧边发育自植物的茎的叶原基。叶内含有叶绿素，是植物进行光合作用的主要场所。同时，植物的蒸散作用是通过叶的气孔实现的。

果实

果实由花的雌蕊发育而来，多数植物的种子包裹在果实里面。草莓的“果实”由花托生长而来，是一个例外。一个果实内部的种子数量各不相同，有些只有一籽，有些则很多。果实成熟时，有些富含水分，有些则变干。

种子

种子是种子植物的胚珠经受精后长成的结构，一般有种皮、胚和胚乳等组成。胚是种子中最主要的部分，萌发后长成新的个体。胚乳含有营养物质。

㈦ 各大航空公司运单号前缀都是多少啊

提单代码 航空公司中文名称 航空公司英文名称 IATA代码 国际代码 所在地
000 伊朗马汉航空 Mahan Airlines W5 伊朗
001 美国美洲航空公司 American Airlines AA AAL 秘鲁
005 美国大陆航空公司 Continental Airlines CO COA 美国-得克萨斯-休斯敦
006 美国达美航空公司 Delta Air Lines DL DAL 美国-乔治亚-亚特兰大
012 美国西北航空公司 Northwest Airlines NW NWA 美国-明尼苏达-伊根
013 加蓬航空 Gabon Airlines GY GBK 加蓬利伯维尔
014 加拿大航空公司 Air Canada AC ACA 加拿大-蒙特利尔
016 美国联合航空公司 United Airlines UA UAL 美国-伊利诺伊州
018 加拿大国际航空公司 Canadian Airlines Int′l CP 加拿大
020 德国汉莎航空 Lufthansa Cargo AG LH DLH 德国-法兰克福
023 美联邦航空公司 Fedex FX 美国
027 阿拉斯加航空公司 Alaska Airlines AS ASA 美国-阿拉斯加
037 美国航空公司 US Airways US USA 美国-得克萨斯-沃斯堡
040 喀麦隆航空公司 Camair-Co UY UYC 喀麦隆
041 捷星亚洲航空 Jetstar Asia Airways 3K JSA 新加坡
042 里约格朗德航空 VARIG RG VRG 巴西里约热内卢
043 港龙航空公司 Dragon Air KA HDA 中国-香港
044 阿根廷航空公司 AEROLINEAS AR ARG 阿根廷-布宜诺斯艾利斯
045 智利航空 LAN Airlines LA LAN 智利-圣地亚哥
047 TAP葡萄牙航空 公司 TAP AIR PORTUQAL TP TAP 葡萄牙
048 塞浦路斯航空 Cyprus Airways CY CYP 塞浦路斯
050 希腊国营奥林匹克航空公司 Olympic Airways OA OAL 希腊
053 爱尔兰航空公司 Aer Lingus EI EIN 爱尔兰-都柏林
055 意大利航空公司 Alitalia AZ AZA 意大利
057 法国航空公司 Air France AF AFR 法国
061 塞舌尔航空公司 Air Seychelles HM SEY 塞舌尔
064 捷克航空公司 CSA Czech Airlines OK CSA 捷克
065 沙特阿拉伯航空公司 Saudi Arabian Airlines SV SVA 沙特阿拉伯航
070 叙利亚阿拉伯航空 Syrian Arab Airlines RB SYR 叙利亚
071 埃塞俄比亚航空公司 Ethiopian airlines ET ETH 埃塞俄比亚
072 海湾航空公司 Gulf Air GF GFA 巴林
074 荷兰皇家航空公司 KLM KL KLM 荷兰
075 西班牙航空公司 Iberia IB IBE 西班牙
076 黎巴嫩航空公司 Lebanese Air Transport LQ LAQ 黎巴嫩
077 埃及航空公司 Egyptair MS MSR 埃及
079 菲律宾航空公司 Philippine airlines PR PAL 菲律宾
080 波兰航空公司 Lot Polish Airlines LO LOT 波兰
081 快达航空公司 Qantas Airways QF QFA 美国
082 比利时航空公司 Brussels Airlines SN DAT 比利时
083 南非航空公司 South African Airways SA SAA 南非
086 新西兰航空公司 Air New Zealand NZ ANZ 新西兰
090 翠鸟航空有限公司 Kingfisher Airlines IT KFR 印度-班加罗尔
096 伊朗航空公司 Iran air IR IRA 伊朗
098 印度航空公司 Air India AI AIC 印度
105 芬兰航空公司 Finnair Oyj AY FIN 芬兰
106 西印度群岛航空公司 BWIA West Indies Airways Limited BW BWA 西班牙
108 冰岛航空公司 Iceland air FI ICE 冰岛
112 中国货运航空 China Cargo Airlines LTD. CK CKK 中国-上海
114 以色列航空公司 El Al Israel Airlines LY ELY 以色列
115 南斯拉夫航空 Jugoslovenski Aerotransport JU JAT 南斯拉夫
117 北欧航空公司 Scandinavian Airlines System SK SAS 瑞典斯德哥尔摩
118 安哥拉航空公司 TAAG – Linhas Aereas de Angola DT DTA 安哥拉-卢安达
119 ALM Airline Inc. Air ALM LM ALM 荷属安的列斯
123 维珍航空 Virgin Atlantic Airways VS VIR 英国
124 阿尔及利亚航空公司 Air Algerie AH DAH 阿尔及利亚-阿尔及尔
125 英国航空公司 British Airways p.l.c. BA BAW 英国-伦敦
126 印尼航空 Garuda Indonesia GA GIA 印尼-雅加达
127 Aviaprima Sochi Airlines Aviaprima Sochi Airlines J5 PRL 希腊
128 香港快运航空公司 HONGkONG EXPRESS UO HKE 中国-香港
129 荷兰马丁航空公司 Martinair Cargo MP MPH 荷兰-阿姆斯特丹
131 日本航空公司 Japan Airlines Company Ltd. JL JAL 日本-东京
132 墨西哥联运航空公司 Aeroméxico Cargo MX MXA 墨西哥
136 古巴航空公司 Cubana de Aviacion S.A. CU CUB 古巴
139 墨西哥航空公司 Aeromexico Cargo AM AMX 墨西哥
140 秘鲁 LIAT 航空公司 LIAT Airlines LI LIA 秘鲁
141 迪拜航空公司 Fly FZ FDB 迪拜
145 拉德科智利航空 Royal Air Maroc UC LCO 智利
147 摩洛哥皇家航空公司 Royal Air Maroc AT RAM 摩洛哥-达尔贝达
155 敦豪航空公司 DHL International E.C. ES DHX 中国-北京
157 卡塔尔航空公司 Qatar Airways (W.L.L.) QR QTR
160 香港国泰航空有限公司 Cathay Pacific Airways Ltd. CX CPA 中国-香港
163 比利时 TNT航空公司 TNT Airways 3V TAY 比利时
165 斯洛文尼亚国际航空公司 Adria Airways – The Airline of Slovenia JP ADR 斯洛文尼亚
167 马拉维航空公司 Air Malawi QM AML 马拉维布兰太尔
172 卢森堡航空公司 Cargolux Airlines International CV CVA 卢森堡-芬德尔机场
173 夏威夷航空 Hawaiian Airlines HA HAL 美国-夏威夷
176 阿联酋航空公司 Emirates EK UAE 阿联酋-迪拜
180 大韩航空公司 Korean Air Lines Co. Ltd. KE KAL 韩国
183 里约格朗德航空 VARIG RG VRG 巴西里约热内卢
186 纳米比亚航空 Air Namibia SW NMB 纳米比亚-温得和克
195 普尔科沃航空公司 Pulkovo Aviation Enterprise Z8 PLK 俄罗斯-圣彼得堡
201 牙买加航空有限公司 Air Jamaica JM AJM 牙买加-金斯敦
202 塔卡国际航空公司 TACA International Airlines TA TAI 萨尔瓦多
203 菲律宾宿务航空公司 Cebu Pacific Air 5J CPI 中国
205 日本全日空航空公司 ANA All Nippon Airways NH ANA 日本-东京
214 巴基斯坦航空公司 Pakistan International Airlines PK PIA 巴基斯坦
217 泰国航空公司 Thai Airways International Public TG THA 泰国-曼谷
229 科威特航空公司 Kuwait Airways KU KAC 科威特
230 巴拿马航空公司 COPA Airlines CM CMP 巴拿马
231 维也纳劳达航空公司 Lauda Air NG LDA 奥地利施韦夏特
232 马来西亚航空公司 Malaysian Airline System Berhad MH MAS 马来西亚-吉隆坡
234 日本佳速航空货运 Japan Air System JD JAS 东京
235 土耳其航空公司 Turkish Airlines Inc. TK THY 土耳其-伊斯坦布尔
236 英国大陆航空公司 British Midland Airways Ltd. BD BMA 英国
239 毛里求斯航空有限公司 Air Mauritius MK MAU 毛里求斯-路易港
254 Jetclub航空 Jet Club 0J JCS 瑞士苏黎世
257 奥地利航空公司 Austrian Cargo OS AUA 奥地利
258 马尔加什国家航空 Air Madagascar MD MDG 马达加斯加
265 远东航空公司 Far Eastern Air Transport FE FEA 中国台北
266 Leisure航空 Leisure Cargo L8 德国
270 跨地中海航空公司 Trans Mediterranean Airways TL TMA 黎巴嫩
272 卡利塔航空 Kalitta Air K4 CKS 美国
279 捷蓝航空 JetBlue Airways B6 JBU 美国-纽约
281 罗马尼亚航空 Tarom RO ROT 罗马尼亚
288 香港华民航空公司 Air Hong Kong LD AHK 中国香港
297 台湾中华航空公司 China Airlines CI CAL 中国-台湾
301 全球航空服务 Global Aviation and Services 5S GAK 利比亚
302 美国 SkyWest 航空公司 Sky West Airlines OO SKW 美国
307 圣图伦货运航空 Centurion Air Cargo WE CWC 美国
312 印地高航空 IndiGo CarGo 6E 印度
317 联盟航空公司 Alliance Airlines 3A AFJ 美国
318 冰岛亚特兰大航空 Air Atlanta Icelandic CC ABD 冰岛
321 德国星光航空公司 Starlight Airlines QP 德国
324 山东航空 Shandong Airlines Co.,Ltd. SC CDG 中国-济南
328 挪威航空 Norwegian Air Shuttle DY NAX 挪威-奥斯陆
331 SATA航空 SATA INTERNATIONAL S4 RZO 圣米格尔
345 北方货运航空公司 Northern Air Cargo NC NAC 美国
355 邮件空运航空 Estafeta Carga Aerea E7 ESF 墨西哥
356 卢森堡国际货运航空公司 Cargolux Italia C8 ESF 卢森堡
369 美国阿特拉斯航空公司 Atlas Air, Inc. 5Y GTI 美国
370 跨地中海航空公司 Trans Mediterranean Airways TL TMA 摩尔多瓦
378 开曼航空 Cayman Airways KX CAY 开曼群岛
390 希腊爱琴海航空 Aegean Airlines A3 AEE 希腊-雅典
403 极地航空货运全球有限公司 Polar Air Cargo PO PAC 美国-纽约州-帕切斯
406 联合包裹航空公司 United Parcel Service 5X UPS 美国
416 National航空 National Air Cargo N8 NCR 美国
417 中南美空运 Bringer Air Cargo E6 BRC 巴西
421 西伯利亚航空公司 Siberia Airlines S7 SBI 俄罗斯-莫斯科
423 敦豪航空公司 DHL Aviation/DHL Airways ER DHL 德国北莱茵
463 阿塞拜疆丝绸之路 Silk Way Airlines ZP AZQ 阿塞拜疆
465 阿斯塔纳航空公司 Air Astana KC 哈萨克斯坦-阿斯塔纳
474 加那利航空公司 BinterSwift Cargo NT IBB 加那利群岛
479 深圳航空公司 Shenzhen Airlines ZH CSZ
485 Astral航空 Astral Aviation 8V ACP 肯尼亚
489 喷气货运航空公司 Cargojet Airways W8 CJT 加拿大
501 丝绸之路航空 Silk Way West Airlines 7L 阿塞拜疆巴库
507 俄罗斯航空 Aeroflot Russian Airlines SU AFL 俄罗斯
512 约旦皇家航空 Royal Jordanian RJ RJA 约旦-安曼
514 阿拉伯航空 Air Arabia G9 ABY 阿拉伯联合酋长国沙迦
519 尼泊尔航空公司 Nepal Airlines RA KTM 尼泊尔
524 澳大利亚航空快递公司 Australian air Express XM JLJ 日本
525 台湾立荣航空 EVA Airways B7 UIA 中国-台湾
526 美国西南航空公司 Southwest Airlines WN SWA 美国-达拉斯
549 巴西 ABSA 航空公司 ABSA Aerolinhas Brasileiras M3 TUS 巴西-坎皮纳斯
552 Mario\’s航空公司 Mario\’s Air M2 佛罗里达州
555 俄罗斯航空公司 Aeroflot Russian Airlines SU AFL 俄罗斯-莫斯科
566 乌克兰国际航空公司 Ukraine International Airlines PS AUI 乌克兰-基辅
572 摩尔多瓦航空公司 Air Moldova 9U MLD 摩尔多瓦基希讷乌
574 联盟航空 Allied Air AJK 尼日利亚-拉各斯
575 英国 Coyne Air公司 Coyne Air 7C COY 英国
576 Skylease航空 Skylease Cargo KY
578 泰国东方航空 Orient Thai Airlines OX OEA 泰国
580 俄罗斯空桥货运航空公司 Airbridge cargo RU ABW 俄罗斯
589 印度杰特航空公司 Jet Airways (India) Limited 9W JAI 印度
603 斯里兰卡航空公司 SriLankan Airlines Limited UL ALK 斯里兰卡-科伦坡
607 阿联酋阿提哈德航空公司 Etihad cristal cargo EY ETD 阿联酋-阿布扎比
615 DHL航空 DHL Aviation GL GRL 德国
618 新加坡航空公司 Singapore Airlines SQ SIA 新加坡
623 保加利亚航空 Bulgaria Air FB LZB 保加利亚
624 巴西天马航空 Pegasus Cargo PC 巴西
629 新加坡航空公司 Silk Air MI 新加坡
630 托马斯库克航空 Thomas Cook Airlines Scandinavia DK VKG 丹麦-哥本哈根
631 格陵兰航空公司 Air Greenland GL GRL 丹麦-努克
635 也门航空 Yemenia Airlines IY IYE 也门
642 墨西哥航空货运 Aeroméxico Cargo QO 墨西哥
643 马耳他航空 Air Malta KM AMC 马耳他 -鲁卡
644 Solar Cargo航空 Solar Cargo
649 越洋航空 Air Transat TS TSC 加拿大
656 新几内亚航空 Air Niugini PX ANG
657 波罗的海航空 Air Baltic BT BTI 拉脱维亚-里加
670 香港空运货站有限公司 UO
672 文莱航空公司 Royal Brunei Airlines BI RBA 文莱 -斯里巴加湾
673 地中海航空公司 TMA Trans Mediterranean Airways N2
675 澳门航空有限公司 Air Macau Company Limited NX AMU 中国-澳门
687 阿罗哈航空货运 Aloha Air Cargo KH AAH 美国
695 台湾长荣航空 EVA Airways BR EVA 中国-台湾
700 中国货运航空 C.A.L. Cargo Airlines Ltd. 5C CAL 中国-上海
706 肯尼亚航空公司 Kendell Airlines KQ KQA 肯尼亚-内罗毕
710 阿班航空 Aban Air K5 ABE 伊朗
711 Movie Reviews Movie Reviews MR
716 土耳其 MNB 航空公司 MNG Cargo Airlines MB MNB 土耳其
723 墨西哥联运航空公司 Aeroméxico Cargo QO 墨西哥
724 瑞士国际航空公司 Swiss International Air Lines LX SWR 瑞士-巴塞尔
729 坦帕航空货运 Tampa Cargo QT TPA 比利时
730 德国航空货运 ACG Air Cargo Germany 6U ACG 德国-哈恩
731 厦门航空公司 XiaMen Airlines MF CXA 中国-厦门
738 越南国家航空公司 Vietnam Airlines VN HVN 越南河内
745 柏林航空 Air Berlin AB BER
749 南非支线航空公司 SA Airlink Airlines 4Z LNK
754 途易航空 Jetairfly TB TUB 比利时
756 比利时 TNT航空公司 TNT Airways 3V TAY 比利时-列日
757 Avient Avient Z3 SMJ
767 大西洋航空 Atlantic Airways RC FLI 丹麦
771 阿塞拜疆航空公司 Azerjan Airlines J2 AHY 阿塞拜疆-巴库
774 上海航空公司 Shanghai Airlines FM CSH 中国-上海
775 森帕蒂航空公司 spiceJet SG
781 中国东方航空公司 China Eastern Airlines MU CES 中国-上海
784 中国南方航空公司 China Southern Airlines CZ CSN 中国-广州
790 马斯航空 MASAir 1A Leaderjet 墨西哥
800 银河国际货运航空有限公司 Grandstar Cargo GD GSC 中国-天津
803 华信航空公司 Mandarin Airlines AE MDA 中国-台湾
807 亚洲航空公司 AirAsia Berhad AK AXM 马来西亚-吉隆坡
810 美国喷气国际公司 Amerijet International M6 AJT 美国
827 鲁斯航空公司 RUS Aviation R4 立陶宛
831 克罗的亚航空 Croatia Airlines OU CTN 克罗的亚
843 亚洲航空 AirAsia D7 KUL 马来西亚
851 香港航空 Hong Kong Airways HX CRK 香港
858 西非航空公司 Africa West FK WTA 英国
862 美国达美航空公司 Atlantic Southeast Airlines EV CAA 美国-亚特兰大
865 墨西哥麦斯航空 MASAir MY MWA 墨西哥-墨西哥
870 乌克兰空中世界航空公司 Aerosvit Airlines VV AEW 乌克兰-基辅
871 扬子江快运航空有限公司 Yangtze River Express Co. Ltd Y8 YZR 中国-上海
876 四川航空 Sichuan Airlines Co.,Ltd. 3U CSC 中国-成都
880 海南航空公司 Hainan Airlines HU CHH 中国-海口
886 美国 Comair 航空公司 Comair OH COM 美国
900 马尔代夫航空 Air Maldives L6 AMI 马尔代夫
901 玻利维亚航空 TAB Transportes Aereos Bolivianos B1 BOL 玻利维亚
907 皇家航空 Air Armenia QN ARR 亚美尼亚
910 阿曼航空公司 Oman Air WY OAS 马斯喀特
932 英国维珍航空公司 Virgin Atlantic Airways Limited VS VIR 英国-伦敦
933 日本货运航空公司 Nippon Cargo Airlines KZ NCA 日本-东京
946 Vensecar国际航空 Vensecar V4 VEC 委内瑞拉
947 危地马拉DHL DHL de Guatemala L3 JOS 危地马拉
950 CHAMP-Test XS
957 巴西塔姆航空公司 TAM Linhas Aereas JJ TAM 巴西
958 Insel Air Cargo Insel Air Cargo 7I INC 库拉索岛
960 爱沙尼亚航空 Estonian Air OV ELL 爱沙尼亚-塔林
976 墨西哥联运航空 Aeromexpress Cargo QO 墨西哥
988 韩亚航空公司 Asiana Airlines OZ AAR 韩国-首尔
989 长城航空公司 Great Wall Airlines IJ GWL 中国-上海
991 吉布提航空 Daallo Airlines D3 吉布提
992 巴拿马 敦豪航空 DHL Aero Expreso D5 DAE 巴拿马
996 欧洲货运航空公司 Air Europa Cargo UX AEA 西班牙
997 孟加拉航空 Biman Bangladesh BG BBC 孟加拉国-达卡
999 中国国际货运航空有限公司 Air China International Corporation CA CAO 中国-北京

㈧ 哪位做过脂肪细胞原代培养

方案 23.12 脂肪细胞的原代培养

实验材料

DMEM-ADMEM-B胶原蛋白酶雄性 Sprague-Dawley 大鼠

试剂、试剂盒

KRBH缓冲液KRBH-A缓冲液

仪器、耗材

Petri培养皿锥形离心管聚丙烯管低密度聚丙烯瓶尼龙滤网尖解剖剪Perry镊塑料箱铡刀移液器

实验步骤

一、切除附睾脂肪垫

1. 在充有 70 % CO2和 30 % O2混合气体的塑料箱内麻醉大鼠（雄性 Sprague-Dawley 大鼠：145~170 g，CD 系（Charles River Breeding Laboratories）。

2. 用铡刀断头放血。

3. 将鼠体在 70 % 乙醇内浸泡一会儿。

4. 尽量在无菌条件下切除附睾脂肪垫。

(a)用一把解剖剪剖开下腹部皮肤，暴露腹膜。

(b)用另一把解剖剪剖开腹膜，然后用 Perry 镊向上牵拉睾丸。

(c)剪取附睾脂肪垫，注意保留血管。

5. 将组织移送到培养实验室。

脂肪细胞的胶原蛋白酶（在 2 ml KRBH 缓冲液加入 20 mg/ml 胶原蛋白酶，然后用 0.22 μm 滤器过滤）消化和洗涤

6. 将 4 g 脂肪垫（相当于 8 个附睾的脂肪垫）放入盛有 4 ml KRBH 缓冲液 （Krebs-Ringer 液，pH 7.4，添加 10 mmol/L NaHCO3、30 mmol/L HEPES（Sigma）、200 nmol/L 腺苷（Boche）和 1 % BSA （W / V，Intergen）。配制 1 L KRBH 缓冲液时，用 7 g NaCl、0.55 g KH2PO4、0.25 g MgSO47H2O、0.84 g NaHCO3、0.11 g CaCl2、7.15 g HEPES、10 g BSA、1 ml 200 μmol/L 腺苷， 加超净水至 1 L。然后，按 100 ml 分装。使用前加热至 37°C，并将 pH 调整至 7.4。）（37°C）的 30 ml 低密度聚丙烯瓶内。

7. 将脂肪垫剪成直径约为 2 mm 的组织块。

8. 将组织块放入瓶内，然后加入 1 ml 胶原蛋白酶液。在 37°C 水浴振荡器孵育约 1 h，直至细胞混合物形成乳脂样浓稠液体。

9. 胶原蛋白酶消化后，向瓶内加入 4 ml KRBH 缓冲液（37°C）。

10. 通过搅拌混匀瓶内的细胞，然后用孔径为 250 μm 的尼龙滤网（孔径为 250 μm，放入支持物或漏斗内）将细胞轻轻滤入 50 ml 锥形离心管。

11. 通过向离心管内加入 30 ml KRBH 缓冲液（37°C）洗细胞。用台式离心机短时间离心（ 200 g），然后用吸管吸出下清液。注意脂肪细胞浮在水性缓冲液的上面。

12. 通过加入 40 ml KRBH 缓冲液洗细胞，离心，除去下清液。重复该步骤 1 次。

13. 用 40 ml DMEM-A （DMEM，pH 7.4，添加 25 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨酰胺、200 nmol/L（R )-N6-（l-methyl-2-phenylethyl）腺苷（PIA，Sigma）、100 μg/ml 庆大霉素和 25 mmol/L HEPES。按 100 ml 分装，使用前加热至 37°C）（37°C）洗细胞 2 次。

14. 用约 40 % cytocrit DMEM-A 混悬漂浮的细胞。

二、脂肪细胞的原代培养

15. 用 200 μl 大口径吸头将 2 ml 40 % cytocrit DMEM-A 悬液移入 60 mm 培养皿。

16. 将培养皿放入湿润的培养箱，在 37°C 和 5 % CO2的条件下培养 1.5 h 。

17. 向培养皿内加入 5 ml DMEM-B（DMEM-A，添加 7% BSA）。

此时，应进行葡萄糖摄取实验 [ Quom 1998 ]，检査细胞的活力。

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中山医科大学学报(AcadJSUMS),2001,22(6):443~446443

人前脂肪细胞的原代培养

王竹晨1,刘建中2,李??燕2,杨冬梓1,邝健全1

(中山医科大学??1.孙逸仙纪念医院妇产科,2.生物教研室,广东广州??510120)

摘??要:??目的 建立人前脂肪细胞原代培养方法,以更深入地研究人体脂肪组织增生的生物学特征。??方法 选用成人的腹部脂肪组织,采用原代消化细胞培养法培养出棱形细胞;同时取皮肤组织,进行成纤维细胞培养作为对照。??结果 培养出的棱形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高。经形态学动态变化的观察,生长曲线及油红O脂肪染色抽取法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞,并在体外重现了其增殖的全过程。??结论 在成熟的脂肪组织中存在着可分化成熟、生成脂肪的前脂肪细胞。由于脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一,本实验为进一步研究与肥胖及胰岛素抵抗相关的疾病如多囊卵巢综合症等打下了基础。

关键词:前脂肪细胞;细胞培养;脂肪组织

中图分类号:Q254,R711.75??????文献标识码:A??????文章编号:1000-257X(2001)06-0443-04

WANGZhu??chen1,LIUJian??zhong2,LIYan2,YANGDong??zi1,KUANGJian??quan1

(1.,SunYat??senMemorialHospital,2.DepartmentofBiology,

SunYat??,Guangzhou510120,China)

Abstract:??Objective .??Methods Usingprimarycellculture,fibroblast??..??Results Thecellswerehighlyhomogeneous,.,growthcurve,,.Undercontrolledconditions,.??Conclusion Inmaturehumanadiposetissue,.,thisstudylaidthebasisforfur??syndrome.

Keywords:preadipocyte;cellculture;adiposetissue

????脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一,与

肥胖及胰岛素抵抗相关疾患如多囊卵巢综合症的

研究关系密切,近年来受到妇科内分泌领域的重

视。前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分

化能力的特异化的前体细胞,它的存在和作用持续

于人的一生,我们从人脂肪组织中培养出了前脂肪

细胞,为进一步研究打下了基础。

????收稿日期:2001-04-23

????基金项目:广东省卫生厅科研基金资助课题(2001189)

????,;1??材料与方法1.1??组织来源选取2000年9月~2001年1月本院妇科内分泌病房行输卵管复通术的正常体重患者。年龄20~40岁,身体健康,无其他急慢性疾病。术中开腹时切取皮下脂肪组织及皮肤组织。

444

1.2??试验材料

1.2.1??主要试验用品和化学试剂??DMEM/F??12培养基(1!1),无支原体胎牛血清,?型胶原酶,Hepes,人转铁蛋白,青、链霉素原液均购自GIBCO公司;生物素、泛酸盐、氢化可的松,三碘甲状腺原胺酸(T3),3??异丁基??1??甲基黄嘌呤均系SIGMA公司产品。牛血清白蛋白购自Roche公司。试验所需无机试剂购自广州市医药公司化试批发部,均系分析纯试剂。培养瓶购自KORNING公司。

1.2.2??培养基及主要试剂的配制??培养基A[1]中山医科大学学报(AcadJSUMS),2001,22(6)培养基A制成细胞悬液,接种至25cm2培养瓶内,密度为每平方厘米3?10个细胞,置37#,体积分数5%CO2培养箱内孵育16h后,PBS轻轻洗去培养瓶内未粘附的物质,换用培养基C诱导和维持脂肪细胞分化,3d后更换为培养基B,以后每2~3d更换一次培养基B。1.3.2??人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞的组织学染色??盖玻片剪成0??5cm?1??0cm大小,接种时置入培养瓶内,待细胞贴壁后每2、3d从培养瓶内取出染色。将贴有脂肪细胞的面朝上,浸入体积分

数为10%甲醛的等渗盐缓冲液中固定10min,然后放入PBS缓冲液中,轻轻漂洗片刻,直立使残留水份流到边缘,吸水纸吸掉。稍干燥后,人前脂肪细胞采用苏丹%??&滴染法及Mayer苏木素复染细胞核,甘油明胶封片;皮肤成纤维细胞采用常规苏木素-伊红染色,脱水透明后中性树脂封片,光镜观察并拍照保留结果。

1.3.3??细胞生长曲线的绘制??将细胞悬液等量接种至24个培养瓶内,随机分成8组,每组3瓶,每2d检测一组中每个瓶中的细胞总数,取3个瓶的均值,如此至第8组结束。细胞计数方法参照医学细胞生物学实验[3]。

1.3.4??油红O染色提取法测定细胞内的脂肪含量??接种方法同1.3.3,根据Ramirez[2]4:按说明取DMEM/F??12培养粉5g,加入胎牛血清使其体积分数为10%,三蒸水定容至500mL;培养基B:按说明取DMEM/F??12培养粉10g,加入终浓度分别为15mmol/LNaHCO3,15mmol/LHep??es,33??mol/L泛酸盐,17??mol/L人转铁蛋白,100000U/L青霉素,0??1g/L链霉素,100nmol/L氢化可的松,60nmol/L胰岛素,0??2nmol/LT3,三蒸水定容至1000mL;培养基C:取培养基A200mL,加入3??异丁基??1??甲基黄嘌呤,使其终浓度为0??25mmol/L;消化液:称取胶原酶(?型)150mg,牛血清白蛋白2g,0??01mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)定容至100mL;红细胞溶解缓冲液:称取适量NH4Cl,K2HPO4和EDTA,使其终浓度分别为154mmol/L,5??7mmol/L,和0??1mmol/L,三蒸水

定容至250mL。上述溶液均经调整pH值至7??4~7??6,0??22??m微孔滤膜正压过滤除菌,分装后置-30#保存。油红O工作液[2]等的方法测定。培养物用体积分数10%甲醛的等渗盐缓冲液固定1h后,蒸馏水漂洗。吸取油红O工作液10mL,使培养面向下浸染,2h后倒掉瓶内的油红O

工作液,蒸馏水漂洗培养瓶数次,直至完全漂浮干净。将已染色的培养瓶置于32#孵箱内蒸发掉瓶内的水份后即加入1mL异丙醇,萃取出的染液即刻用吸管移出,于HITACHIG2000型分光光度计510nm波长处测吸光度。:称取4??2g油红O溶于1200mL异丙醇中室温静置过夜,分析滤纸过滤后收集滤液,并加入900mL三蒸水,于4#再次静置过夜后过滤两次即可于室温贮存备用。1.2.3??仪??器??CO2培养箱,倒置显微镜等。1.3??方??法

1.3.1??人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞的原代培养[1]??术中切取脂肪组织约60g,同时切取皮肤组织约0??5cm?3cm进行成纤维细胞培养作为对照。PBS洗涤,分离去除脂肪组织中肉眼可见的纤维成份及血管,皮肤组织则需去除表皮和皮下脂肪,剪碎成约2mm?2mm的小块,加入消化液,置37#,体积分数5%CO2培养箱内消化。15h后,200?g短时离心,去除漂浮的脂肪细胞及培养液,沉积的细胞用红细胞溶解缓冲液再次配成细胞悬液,37#孵育10min,以去除污染的红细胞,150??2??结??果2.1??原代培养的人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞形态学观察细胞贴壁后初为小圆形,核/浆比例较大(图1??1),4d即可观察到细胞渐成梭型,7d左右此棱形细胞大量繁殖,面积达到培养瓶底1/2之后开始积聚脂肪颗粒(图1??2)。9d可观察到细胞由棱形渐变成椭圆形或圆形(图1??3),积聚有脂肪颗粒的

第6期??王竹晨,等.人前脂肪细胞的原代培养445肪细胞(图1??4)。体外培养的脂肪细胞体积较大,细胞膜较薄,膜轮廓不光滑,凹凸不平有皱折,胞质内有大量圆形脂滴,大小不等且多散在,也有小脂滴大量触合成大脂滴的情况,核仍位于边缘,而同时培养的皮肤成纤维细胞增殖速率相似,但始终为长棱形,无脂滴积聚(图2??1,图2??2)。

2.2??人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞的生长曲线

由生长曲线可见人前脂肪细胞(图3??1)和皮肤成纤维细胞(图3??2)的倍增时间分别为60h和55h

。3??讨??论3.1??人前脂肪细胞培养在妇科内分泌领域的研究意义脂肪细胞是脂肪组织的重要组成部份,也是其发挥功能的主体。当代研究认为脂肪组织中脂肪细胞非常活跃,细胞的数目,形态及细胞内脂肪的含量均处于动态变化之中,并保持终生。肥胖症被认为是脂肪细胞增殖和分化失控的结果。目前,肥

胖已成为与妇科内分泌领域密切相关的疾病,肥胖可产生胰岛素抵抗/高胰岛素血症,而胰岛素抵抗/高胰岛素血症是许多临床疾病或病症,尤其是常见的内分泌代谢性疾病如糖尿病、高血压和动脉粥样硬化等的共同危险信号,因此成为近年医学多学科共同感兴趣的研究热点。特别是近年的研究发现

图3.1??人前脂肪细胞生长曲线

Fig.3.1??

culture胰岛素抵抗/高胰岛素血症还与育龄妇女高雄激素血症及无排卵有关。临床常见的多囊卵巢综合症,

生育年龄妇女中约有5%~10%患者此症,常伴有肥胖,病因不明。目前认为多囊卵巢综合症即是以胰岛素抵抗为特征的内分泌代谢性疾患,继发于胰岛素抵抗的高胰岛素血症对造成高雄激素征象起着重要作用,并致不孕[4]。脂肪细胞作为对胰岛素

图3.2??人皮肤成纤维细胞生长曲线

Fig.3.2??敏感的靶细胞之一,因此对其潜在胰岛素抵抗机制的研究具有特殊临床意义。体外前脂肪细胞培养

能完整地认识脂肪组织的发生和增生的全过程,并且可以直接观察各种因素对这个过程的调控,研究其机制,是研究脂肪组织的理想模型。国外虽已建立了来源于鼠的前脂肪细胞的细胞株如3T3??L1、3T3??F442A,ob17系列等,但到目前为止,尚未见有人的前脂肪细胞株建立[5],因而使进一步的研究受到了限制。

3.2??体外培养的人前脂肪细胞的生物学特性

目前国内外前脂肪细胞体外培养系统大致有两类,一类来源于血管基质组份细胞(stromalvas??cularfraction,SVF),这是经典的前脂肪细胞。Van等[6]对SVF的系统研究形成了完整的前脂肪细胞理论。他们将切下的脂肪组织用胶原酶处理,再将组织悬液离心,其中的沉淀物基质血管成份即是SVF,将其SVF进行培养,和培养的成纤维细胞比较,这两种培养物以差不多的速率增殖,倍增时间约55h左右。在显微镜下比较细胞,发现起初2.3??前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞生长过程中细胞内脂肪含量的变化前脂肪细胞内的脂肪含量于培养9d后迅速增加,16d左右到达高峰,而皮肤成纤维细胞内仅有极少的脂肪积聚(图4)

。图4??前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞生长过程中细胞内脂肪含量的变化Fig.4??lture

446

可积聚大量脂滴,而成纤维细胞的胞浆内则无或只有少量的脂滴。这就证明了SVF是具有增殖和向脂肪细胞分化潜能的前脂肪细胞。本实验研究结果与之相符,符合文献中提出的3个标准[6]。此外,近年还有人报道采用脂肪组织块贴壁和天花板培养相结合的方法也获得了成功[7]。此种方法得到的前脂肪细胞与SVF不同,可能来源于Carraro等发现的成熟脂肪细胞内都有的一种细胞岛[8]。但此种方法是采用有血清培养并且与成熟脂肪细胞共同孵育,不适于作为成熟脂肪细胞所分泌的某些细胞因子的体外研究模型。

前脂肪细胞的培养阐明了其增殖和分化的关系,目前认为这是一种生长停顿?生长再续?细胞分化的连续关系。生长停顿是必要的第一步,此后这些细胞至少进行一次以上的再分裂,才继续向成熟脂肪细胞转化。并随时间的推移出现甘油??3??磷酸脱氢酶(GPDH)mRNA这个晚期标志物,这也是脂肪合成所必需的限速酶,并最终变成脂肪细胞。我们的研究也观察到细胞贴壁后经过一段时间的潜伏期后开始生长,3、5d左右大量增殖,1周后开始有脂肪颗粒的积聚。培养2周时,分化成多脂滴或单脂滴的脂肪细胞,与文献报道一致。

油红O染色提取法可简便、快速地对体外培养的前脂肪细胞转化率进行定量。文献报道其准确性和敏感性与测定前脂肪细胞分化过程中的标志酶GPDH相似[2]。因此常用来作为对体外培养的前脂肪细胞进行鉴定。体外培养的前脂肪细胞在胰岛素、氢化可的松等的作用下,GPDH即开始上升并迅速增加,8d左右达到高峰并维持在高水平[2]。我们采用油红O染色提取法进行研究,结果表明,前脂肪细胞在培养第3天即开始有脂肪的积聚,1周后积聚量明显增多,2周时达到高峰,与形态学上的培养1周后细胞内开始出现脂肪颗粒相吻合。并说明酶的出现在先,脂肪出现在后,细胞内脂肪含量的明显增加比GPDH的出现要晚1周左右,与文献报道相吻合[2]。

3.3??人前脂肪细胞培养技术的特点

脂肪组织来源于原始的网状结缔组织,由结缔组织和脂肪细胞组成,细胞成分中以脂肪细胞为主,此外还含有网状细胞,间充质细胞,组织细胞,内皮细胞等。脂肪细胞和成纤维细胞均来自中胚层,因此培养脂肪细胞和培养成纤维细胞具有相似[9]中山医科大学学报(AcadJSUMS),2001,22(6)外培养条件有差异[10],不同的是需要促脂肪形成因子的作用,目前已知的这类物质有:胰岛素、糖皮质激素、甲状腺素、生长激素、转铁蛋白,3??异丁基??1??甲基黄嘌呤,纤维粘连素等。培养基一般采用DMEM和F12按1!1比例配制,细胞数量适中,初次接种时细胞贴壁不十分牢固,动作要轻柔以免细胞漂浮。选用的取材对象越年轻越容易生长。人类一般选用外科手术切取腹部脂肪组织,如用注射器抽吸则易损伤细胞,降低成活率。(本文图1,2见插页2)参考文献:[1]HaunerH,PetruschkeTH,RussM,etal.(TNF??)??[J].Dibetologia,1995,38(7):764.[2]Ramirez??ZacariasJL,Castro??MunozledoF,kuri??Har??cuchW.??[J].Histochemistry,1992,97(6):493.[3]赵??刚,刘建中.医学细胞生物学实验与习题[M].北京:科学出版社,1999.35.[4]DunaifA.??drome[J].Endocrinol&MetabClinNorAm,1999,28(2):341.[5]BillingsE,MayJW.Historicalreviewandpresentsta????constructivesurgery[J].PlastReconstrSurg,1989,83(2):368.[6]VanRLR,BaylissCE,RoncariDAK.rsinculture[J].JClinInvest,1976,58(9):699.[7]朱晓海,何清濂,林子豪.人前脂肪细胞培养及增殖与分化模型的建立[J].中华整型烧伤外科杂志,1999,15(3):199.[8]CarraroR,LiZH,JohnsonJE.ntratadipocytes[J].CellTissRes,1991,264(2):243.[9]刘??清,邓漪平.内皮-平滑肌联合培养:细胞间相互作用对组织型纤溶酶原激活剂的影响[J].中山医科大学学报,1992,13(4):18.[10]朱永源,利天增,苏爱云,等.人表皮细胞的体外培养[J].中山医科大学学报,1998,19增刊:34.(??,)