trx硫氧还原蛋白检测试剂盒

⑴ 质粒图谱怎么看

1.第一步，看箭头：

大多数质粒都会有箭头，箭头有两种解释。一种是转录方向，转录方向主要是由启动子开始的一个大箭头，是启动子启动序列的顺序。另一种是复制起始位点的方向，复制起始位点就是该质粒在大肠杆菌等细菌或真菌中DNA复制的一个方向。

还需要提到的是F1启动子（图上的f1 ori）代表的是噬菌体的复制起始方向，只能复制出单链的DNA哦，但是可以用来测序。看懂转录的方向，这样就方便设计插入片段的位置和方向性。

2.第二步，看上面的标签。

报告基因：通常会有一两个蛋白，被用作报告基因，比如常见的copGFP（绿色荧光蛋白），Puro（嘌呤霉素），Lacz（乳糖操纵子）等等。和抗性基因不同，这样的报告基因，并不是为了在大肠杆菌扩增质粒的过程中起作用的。

而是在质粒转入表达体系后起到作用的，基本上就是为了显示过表达或是敲减的基因是否正常运作。有的报告基因会融合在蛋白中表达，有的会另外用一个独立的启动子进行表达（比如shRNA的质粒中）。

3.第三步，看多克隆位点：

MCS（Multiple Cloning Site，也就是多克隆位点），一般图中会把多克隆位点上的酶切位点都标记出来。上面的酶切位点顺序，一般都是按照5`-3`的顺序排列下来的，需要注意的是这样几点。

第一点是要注意，酶切位点边标注了*的一般是指并不仅仅存在一个位点，也就不能用来作为构建质粒的酶切位点。

第二点需要注意的是，有的酶切位点，在序列中只有一个，但它上面也会标注一个*或者（dam），这说明可能这个酶切位点会有CpG岛的甲基化修饰[常见的是XbaI，TCTAG(6m)A中的TC无法切开]，一般也是不能用的。但是非要用这个酶切位点的话，就需要用非甲基化的感受态细胞，如JM109或者JM110。

4.第四步，看多克隆位点的序列：

末端如果有差异的话，可以把基因的ATG（甲硫氨酸）的5`末端替换1-2个碱基（变成GTG或者GCG这样），从第二个氨基酸序列开始完全一致即可。而配合扩增和酶切的话，插入片段是允许有3`末端的冗余。

为了可以应付3`末端的冗余碱基，在多克隆位点序列后，会有译码的终止TAA密码，即使插入的片段使得3`末端产生了移码突变，照样能使表达的蛋白正常终止掉（在酵母双杂的AD质粒中，由于插入的是随机cDNA，所以AD的载体上会常见这样的结构）。

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分类

1.根据质粒能否通过细菌的接合作用，可分为接合性质粒和非接合性质粒。

接合性质粒带有与接合传递有关的基因。非接合质粒在一定条件下通过与其共存的接合质粒的诱动或转导而传递。

2.根据质粒在细菌内的复制类型可分为两类：严紧控制型和松弛控制型。

严紧控制复制型质粒的复制酶系与染色体DNA复制共用，只能在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体停止复制时，质粒也就不再复制。

松弛控制复制型的质粒的复制酶系不受染色体DNA复制酶系的影响，在整个细胞生长周期中随时都可以复制，在染色体复制已经停止时质粒仍能继续复制。

3.根据质粒的不相容性，可分为不相容性和相容性。

不相容性指结构相似、密切相关的质粒不能稳定地共存于同一宿主细菌内的现象，反之为相容性。常用于流行病学的调查。

⑵ trx是什么意思

trx悬挂训练;硫氧化还原蛋白;硫氧还蛋白;蛋白;收发信机。

Trx has various biological functions in keeping stable redox status of cells.

硫氧还蛋白具有多种生物学功能，对维持体内稳定的氧化还原状态具有重要的作用。

Construction of recombinant adenovirus vector with TRX gene by Tet-Off inction.

Tet-Off诱导的硫氧还蛋白基因重组腺病毒载体的构建。

These studies have shown that: TRX can suppress tumor cell apoptosis.

研究表明：TRX可以抑制肿瘤细胞凋亡。

Trx plays crucial roles in regulating cell growth, apoptosis and gene transcription.

Trx具有调节细胞生长、抑制凋亡、调节基因转录等功能。

CONCLUSION: TRX protein plays an important role in the defense response of myocardium against oxidative stress.

结论：TRX蛋白在心肌的氧化应激防御反应中起重要作用。

⑶ 去哪购买比较好点的PGK启动子的载体

摘要： HAP转录因子(HAP2/HAP3/HAP4/HAP5) 是存在于酿酒酵母中的一种异源多聚蛋白，它能与酵母中许多启动子上游的CCAAT盒（顺式作用元件）专一性结合， 以增强基因的转录。在酵母hap5突变株的细胞中，用酵母单杂交系统从水稻cDNA-GAL4表达文库中筛选出的阳性克隆是编码谷胱甘肽氧还蛋白的cDNA，提示细胞内的氧化还原系统可能作用于HAP蛋白，从而对CCAAT盒的结合活力起调节作用。 对HAP3亚基分子中半胱氨酸残基的突变实验结果支持上述推测。
关键词： CCAAT，HAP复合物， 转录因子，氧化还原系统

DNA-Binding Activity of the Transcription Factor HAP Is Regulated by Cellular Redox

YAO Quan-Hong, XING Yan-Yan, WANG Zong-Yang, ZHANG Jing-Liu and HONG Meng-Min

Shanghai Institute of Plant Physiology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032

Abstract：The CCAAT binding factor of brewer's yeast Saccharomyces cerevisiae has been shown previously to be a heteromeric complex containing HAP2, HAP3, HAP4 and HAP5 subunits. This factor can bind specifically to CCAAT-containing upstream sites within the promoters of numerous yeast genes, and then activate the transcription. By using a yeast one-hybrid system, we tried to isolate the counterpart of the yeast HAP5 gene from rice cDNA-Gal4 fusion library constructed in a E.coli-yeast shuttle vector pPC86. However, we identified a cDNA encoding glutaredoxin (Fig．1). The results indicte that the cellular redox environment of yeast cell may be a factor regulating the CCAAT-box-binding activity of the HAP3 subunit (Table 1). The results of the HAP3 mutants in which the highly conserved cysteine resies at positions 68 and 72 had been converted to serine support the above suggestion (Table 2).
Key words: CCAAT, HAP complex, transcription factor, redox system

真核基因转录起始时，有一些被称为转录因子的核蛋白会结合在真核基因启动子上游的顺式作用元件上，以增强或阻遏真核基因的转录(Wolberger 1993)。 有些转录因子要经过磷酸化或二聚化，引起蛋白分子的构型发生一些改变后，才具有与DNA结合的能力（Hunter和 Karin 1992）。最近Zheng 等（1998）报告，有些转录因子与DNA 的结合活力受细胞中的氧化还原状态的调节。例如，用凝胶滞后试验在体外研究Jun和Fos转录因子与含Ap-1结合位点的DNA的结合作用时，观察到硫氧还蛋白(thioredoxin)、还原辅酶Ⅱ(NADPH)与硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin rectase)可明显提高它们的异源二聚体与DNA的结合能力(Abate等1990)。
在一些真核基因转录起始点上游存在核心序列为CCAAT的顺式元件，该元件可呈正、反两种方向(Van Huijsijnen等 1987)。 已知酿酒酵母中至少有16种基因的5’端上游都含CCAAT元件。与这些基因上游的CCAAT结合以调节基因转录的反式作用因子是HAP复合物(Pinkham和Keng 1992)， 它是由HAP2、HAP3、HAP4和HAP5 四个蛋白亚基组成的异源多聚体，其中HAP2和HAP3都含有DNA结合域，但单独的HAP2和HAP3蛋白都不具DNA结合活性，只有当HAP2与HAP3 通过它们的亚基结合域形成二聚体蛋白时才构成一个完整的CCAAT盒结合功能域(Xing 等1993) 。而且体内与体外的研究都证实，这种复合功能域的形成还需要HAP5亚基的参与（McNabb等1995）。HAP4亚基含有活化结构域(activation domain)，起活化基因转录的作用(Foraburg和Guarente 1989)。近年来，已从粟酒裂殖酵母、小鼠、大鼠、人等生物中克隆了编码CCAAT盒结合蛋白的基因， 这些CCAAT结合蛋白与酵母HAP转录因子类似蛋白间存在高度同源的结构域(Van Huijsijnen等1990)；在高等植物中， 也已从油菜中克隆了与HAP2亚基中DNA结构域高度同源的基因(Albani和Robert 1995)。
我们曾报告，用酿酒酵母CYC1基因启动子上游含CCAAT盒的DNA片段为“鱼铒”，在HAP2基因突变的酵母细胞中，用酵母单杂交方法从水稻cDNA-GAL4 表达文库中筛选出了编码HAP2类似蛋白的cDNA克隆(姚泉洪等待发表)。本研究用相似的方法，在HAP5突变的酵母细胞中，用酵母单杂交方法， 试图从水稻cDNA-GAL4 表达文库中筛选出编码水稻HAP5类似蛋白的cDNA。但HAP5类似cDNA没有筛到，却几次筛选到水稻中编码谷胱甘肽氧还蛋白(glutaredoxin)的cDNA。这一意外的结果提示我们HAP转录因子与DNA结合受氧化还原（redox）调节的可能性。 本文报告上述实验结果以及对HAP3亚基中半胱氨酸残基进行的突变实验，并就HAP转录因子的DNA结合活力是否受氧化还原调节的问题进行了讨论。
1 材料与方法
1.1 工具酶与化学试剂 限制性内切酶和其它基因工程工具酶为德国Boeringer公司产品，X-gal购自Sigma公司，其它化学试剂为美国Sigma公司或国产AR级试剂。
1.2 菌种和质粒 MC8为氨基酸缺陷型大肠杆菌菌株(thi－,trp－,ura－,leu－,his－)。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）hap5缺陷型菌株为Δhap5-10 (MATα,leu 2-3,112,ura3-52,his4-519,adel-100,trp1 Δhap5)。大肠杆菌-酵母穿梭载体pLG Δ-265 UP1带有lacZ报告基因、URA选择标记、2μ复制序列和酵母CCAAT盒。lacZ报告基因由CYC1的基本启动子控制，而含CCAAT盒的DNA片段位于CYC1的基本启动子上游，此元件被转录因子结合后，即可调节lacZ基因的表达。酿酒酵母-大肠杆菌穿梭载体pPC86带有色氨酸合成酶基因，系朱群博士赠送。pDB20(HAP5)质粒带LEU选择标记，该载体由ADH1启动子控制酵母HAP5基因的表达用作鉴定水稻类似HAP5 cDNA时的阳性对照。pYP2质粒由本实验室构建，它带有PGK启动子及色氨酸合成酶基因，PGK启动子后的BamHⅠ和KpnⅠ切点间插入用于表达的cDNA。
1.3 PCR引物 酵母pPC86载体cDNA插入5'端Gal4激活功能域侧的引物为：GAL4(5'-GGATGTTTAATACCACT-3'）,3'端ADH终止子侧的引物为：TAD4(5'-TTGATTGGAGACTTGACC-3')。水稻谷胱甘肽氧还蛋白cDNA(Minakichi等1994)两侧的引物分别为：5'端翻译启始密码子ATG附近的引物Gluta1(5'AAGGATCCATGGCGCTCGCCAAGGCCAAG 3'), 3'端翻译终止密码子TAG附近的引物Gluta2(5' 3')。酿酒酵母HAP3基因(Hahn等1988)两侧的引物分别为：5'端翻译起始密码子ATG附近的引物HAP3Z1(5'AAGGATCCATGAATACCAACGAGTCC 3')，3'端翻译终止密码子TGA附近的引物HAP3F1(5'TTGTGGTACCTCAAGGCACCTCTTCG 3')。用于酿酒酵母HAP3基因第68位Cys突变为Ser的内侧突变引物分别为：含突变碱基的5'端引物HAP3Z2(5' CGAAAGAGTCCATGCAGGAG 3')，含突变碱基的3'端引物HAP3F2(5'CTCCTGCATGGACTCTTTCG 3')。用于酿酒酵母HAP3基因第72位Cys突变为Ser的内侧突变引物分别为：含突变碱基的5'端引物HAP3Z3( 5'CATGCAGGAGTCTGTCAGTG 3') ，含突变碱基的3'端引物HAP3F3(5'CACTGACAGACTCCTGCATG 3')。
1.4 酵母表达型水稻cDNA库 构于酵母载体pPC86的水稻IR36幼苗的表达型cDNA库由美国Salk研究所的朱群博士提供。
1.5 培养基 大肠杆菌MC8生长于添加亮氨酸、尿嘧啶、组氨酸、维生素B1的M9基本培养基， 用于选择带有水稻cDNA的pPC86质粒。含2％葡萄糖或2％乳酸的酿酒酵母丰富培养基YPD、基本培养基SC及酵母X-gal培养基的制备参照Sherman（1991）的方法。
1.6 酵母感受态细胞的制备及质粒转化 酿酒酵母的质粒转化选用Gietz等(1992)的醋酸锂法。于30℃过夜培养5 ml酿酒酵母至OD600为0.5左右，扩大培养至50ml,再生长4h后，5000×g离心8min收集细胞。以20ml无菌水洗，然而把离心收集的酵母以10ml新配的LiAc溶液100mmol/L(用pH 8.0的Tris 10mmol/L、 EDTA 0.1mmol/L 缓冲液配制)洗1次。7000×g离心8min后，最终将酵母细胞悬于0.5ml的LiAc溶液中。50μl的酵母悬液中加入 1μg的质粒DNA、50μg的鲑鱼精DNA及300μl含40% PEG3350的LiAc溶液，充分混匀后于30℃保温30min。接着于42℃热激15min。把离心收集的酵母细胞重悬于TE溶液中，并涂于酵母选择培养基。
1.7 DNA操作 酵母DNA的快速抽提按Robzyk和Kassir（1992）的方法。DNA操作按标准的分子克隆步骤（Sambrook等1989）。大肠杆菌的电击转化按Dower等(1988)的方法。抽提含水稻cDNA阳性质粒的双链DNA，在ABI 377型DNA自动化测序仪上进行序列测定。 引物GAL4与TAD4间的PCR扩增反应条件为：94℃ 40s, 42℃ 50s, 72℃ 3min，共扩增30个循环。水稻谷胱甘肽氧还蛋白cDNA两侧引物Gluta1和Gluta2间的PCR扩增反应条件为：94℃ 30s, 66℃ 45s， 72℃ 30s，共扩增30个循环。酵母HAP3基因的定点突变采用重叠延伸法(Ho等1989)。HAP3外侧引物间及外侧引物与内侧引物突变间的PCR扩增反应条件为：94℃ 30s, 48℃ 40s，72℃ 30s，共扩增30个循环。
2 结果
2.1 酵母单杂交法筛选水稻中类似酵母HAP5基因的cDNA
酵母单杂交体系最初是由Wang和Reed (1993)所设计,它含两个质粒：其一为酵母表达质粒，用于表达cDNA与GAL4激活功能域的融合蛋白;另一质粒将一个顺式作用元件与带有基本启动子的细菌lacZ报告基因连接，该载体称作鱼饵质粒。本实验酵母单杂交体系中所用的鱼饵质粒为pLGΔ-265 UP1，该载体是把含CCAAT的顺式作用元件插入到178载体中CYC1基本启动子上游构建而成。我们先将鱼饵质粒pLGΔ-265 UP1转化入酵母菌株Δhap5-10，在不含尿嘧啶的平皿上得到转化子Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1)。然后将30μg含水稻cDNA的pPC86载体转化到感受态酵母中，于不含尿嘧啶和色氨酸的培养基上培养。得到3×106左右的转化子，用硝酸纤维膜将这些转化子复印至X-gal平板上进行显色反应。作为阳性对照，含HAP5基因表达载体pDB20(HAP5）及鱼饵质粒pLGΔ-265 UP1的Δhap5-10酵母菌株经培养6 h后已显蓝色。而含水稻cDNA库的质粒pPC86的Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1)酵母菌株2 d后才出现蓝色菌落。此实验重复进行了4次，一共获45个蓝色酵母菌落。
2.2 酵母阳性菌落的重复筛选
为了验证初筛得到的酵母阳性菌落中是否含有相似于HAP5功能的cDNA克隆，从上述45个酵母阳性菌落中抽提DNA，用电击法将DNA转化到大肠杆菌MC8中，培养于2YT+Ap平板，然后复印至不含色氨酸的M9培养基平板上培养。因为pPC86质粒上带有编码TRP合成酶的标记基因，因此能生长出的菌落表明它带有pPC86质粒。然后再从能在不含色氨酸M9培养基上生长的大肠杆菌中抽提质粒DNA，将这些质粒DNA分别转化到酵母Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1)菌株中，于X-gal平板上进行显色，从中鉴定出能使酵母菌落重复变蓝的cDNA克隆17个。
2.3 阳性克隆的鉴定和测序
由于hap5缺陷型酵母不能在含非发酵性碳源的培养基上生长，我们将4次酵母单杂交筛选并经复筛后留下的17个阳性质粒转化入Δhap5-10缺陷型酵母进行功能互补法鉴定。结果表明，这些含水稻cDNA的阳性质粒都不能使hap5缺陷型酵母在非发酵性碳源的培养基上生长。它们都没有补偿缺陷型酵母中所缺失的HAP5的功能，因此不是编码类似HAP5的cDNA克隆。为了弄清它们的结构，我们以GAL4和TAD4为引物进行PCR扩增。并对扩增出的cDNA顺序分别进行Sau3AⅠ酶切，根据酶切带型对各批筛出的cDNA进行归类。结果表明，17个中有6个筛出的阳性cDNA具类似酶切带型；4次筛库中有3次获得该类cDNA克隆。我们以GAL4和TAD4两引物直接对具相似酶切带型、编号为C3的cDNA进行DNA序列分析，图1的结果显示其核苷酸与已报道的水稻谷胱甘肽氧还蛋白cDNA序列完全相同(Minakichi等1994)。我们又按照所测出的水稻谷胱甘肽氧还蛋白cDNA的核苷酸顺序，合成了cDNA两端的寡核苷酸引物gluta1和gluta2，并对所获的6个具相同酶切带型的cDNA克隆进行PCR扩增，结果也确证它们都是编码水稻谷胱甘肽氧还蛋白的cDNA。

图1 水稻C3 cDNA克隆的核苷酸顺序及推导的氨基酸序列

Fig.1 Sequence of the C3 cDNA clone and predicted amino acid sequence

2.4 C3所编码的谷胱甘肽氧还酶对HAP复合物DNA结合活性的影响
以C3的DNA为模板，用两端分别存在BamHⅠ和KpnⅠ酶切点的gluta1和gluta2为引物进行PCR扩增。将此含glutaredoxin基因完整编码区的PCR扩增片段经BamHⅠ和KpnⅠ酶切后克隆到酵母表达载体pYP2中PGK启动子后的相应酶切点间，构成酵母重组质粒pYP3。接着将pYP2、pDB20、pDB20(HAP5)与pYP3等4种质粒分别转化到已经带有质粒p178或pLGΔ-265 UP1的两酵母菌株Δhap5-10(p178)和Δhap5-10(pLGΔ-265 UP1)中。将上述4种质粒分别转化两株酵母菌株。这两株酵母菌株为hap5突变株，但含有具激活功能的HAP4蛋白，有结合功能的HAP2、HAP3蛋白。在不含尿嘧啶和色氨酸的培养基上得到转化子，并将这8种酵母转化子用硝酸纤维素膜分别复印至X-gal平板上进行显色反应，2 d后转化子Δhap5-10( pYP3+pLGΔ-265 UP1)显蓝色，阳性对照菌株Δhap5-10(pDB20(HAP5)+pLGΔ-265 UP1)菌落呈深蓝色，而阴性对照菌株Δhap5-10(pYP2+pLGΔ-265UP1)和Δhap5-10(pDB20+pLGΔ-265 UP1)以及4种质粒在酵母菌株Δhap5-10(178)中的转化子都没有蓝色显现(表1)。说明glutaredoxin能使HAP2、HAP3与HAP4在没有HAP5的情况下使lacZ基因得到表达。

表1 C3所编码的glutaredoxin对鱼饵质粒上lacZ基因表达的影响

Table 1 Effects of glutaredoxin encoded by C3 on the lacZ gene expression in t plasmid

Plasmid Expression of lacZ gene
p178 pLGΔ-265 UP1
pYP2 － －
pDB20 － －
pDB20(HAP5) － +++
pYP3 － +

2.5 HAP3蛋白Cys位点突变对HAP复合物DNA结合活性的影响
在hap5缺失型酵母细胞中，glutaredoxin能使HAP2、HAP3与HAP4一起使lacZ表达。由于已知glutaredoxin是参与调节细胞氧化还原状态（redox）的主要成分，因此我们推测它对HAP蛋白的作用可能是调节HAP蛋白中－SH与－S－S的可逆反应。为弄清它是否起这种作用，我们将HAP3基因第68位及第72位Cys突变为Ser，来验证此种推测是否正确。方法是以Δhap5-10菌株DNA为模板，分别以HAP3Z1、HAP3F2及HAP3Z2、HAP3F1这两对引物进行PCR扩增。再以回收的两个PCR产物为模板，通过HAP3Z1和HAP3F1引物扩增出第68位Cys突变为Ser的HAP3基因。并以同样的方法获得第72位Cys突变为Ser的HAP3基因。分别将HAP3基因及两突变基因的BamHⅠ和KpnⅠ酶切产物克隆入pYP2酵母表达载体，构成带有HAP3基因的质粒pYP4、带有第68位Cys突变为Ser的HAP3基因的质粒pYP5及第72位Cys突变为Ser的HAP3基因的质粒pYP6。接着把pYP4、pYP5和pYP6质粒分别转化入含质粒p178和pLGΔ-265 UP1的酵母Δhap5-10菌株中，在不含尿嘧啶和色氨酸的培养基上选择酵母转化子。转化子用硝酸纤维膜复印至X-gal平板上进行显色反应，2 d后两种带有HAP3发生突变基因的质粒的转化子在没有glutaredoxin存在的情况下都显示出蓝色。而带有正常HAP3基因质粒的转化子没有显示蓝色，且转化到Δhap5-10(178)菌株中的4种转化子也没有显示蓝色(表2)。该结果说明在hap5基因突变酵母细胞中，－SH被突变后的HAP3亚基与细胞中的HAP2、HAP4，即能在单杂交系统中使lacZ基因组成性地表达，而无需glutaredoxin的氧还调节。
表2 HAP3蛋白Cys位点突变对鱼饵质粒上lacZ基因表达的影响

Table 2 Effects of mutant HAP3 at cysteine resies on the lacZ gene expression in t plasmid

Plasmid Expression of lacZ gene
p178 pLGΔ-265 UP1

pYP2 － －
pYP4 － －
pYP5 － +
pYP6 － +

3 讨论
细胞中存在多个调节细胞氧化还原(redox)状态的系统，其中之一为谷胱甘肽氧还蛋白系统，此系统包含谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶与谷胱甘肽氧还蛋白(Holmgren 1989)。该系统通过谷胱甘肽氧还蛋白中半胱氨酸残基上的－SH氧化成－S－S－键或可逆地还原成－SH来调节细胞中的redox状态。这种redox状态也促使某些功能性蛋白分子上的－SH或－S－S－随即发生可逆的氧化或还原，并引起蛋白分子的构型改变，从而影响蛋白分子的活性、稳定性与正确的折叠等重要功能(Holmgren 1989)。
我们在HAP2酵母突变株细胞中，用酵母单杂交方法从水稻cDNA-GAL4 表达文库中成功地筛选到水稻中与HAP2类似的基因RAPB，且RAPB基因可互补酵母的hap2缺陷。这表明用此套单杂交系统来筛选转录因子基因是有效的。按推理，用相同的酵母单杂交系统，在酵母hap5突变株细胞中也应能筛选到水稻的HAP5类似基因，但是所得到的阳性cDNA克隆都不能互补酵母HAP5的缺陷性状。对所得到的阳性cDNA克隆进行核苷酸顺序分析的结果表明，从水稻cDNA文库中得到的这些cDNA所编码的是谷胱甘肽氧还蛋白，而不是期望的水稻编码类似酵母HAP5蛋白。Minakichi等(1994)曾报告水稻glutaredoxin基因的表达主要集中于种子中，而在叶片中的表达很低。而4次筛水稻叶片表达型库过程中有3次筛到glutaredoxin基因，这说明这一实验结果并非偶然。至于为何未筛到HAP5类似基因，是由于我们所用的水稻cDNA-GAL4表达文库中没有HAP5-cDNA，还是由于水稻中没有类似此功能的基因，这还有待进一步研究。
酵母功能互补试验显示水稻glutaredoxin基因没有明显的互补HAP5基因的活性；酵母单杂交试验的结果也说明水稻glutaredoxin基因增强lacZ基因表达的活性远低于HAP5基因。有人推测酵母HAP5蛋白的功能可能是与HAP2和HAP3两亚基间发生疏水相互作用，从而促使形成一种稳定的能结合CCAAT盒的复合结构(McNabb等1995)。如果这种推测是正确的话，那么glutaredoxin的作用也可能是使HAP3亚基保持－SH基状态，从而使HAP2和HAP3之间形成一种不稳定的与CCAAT盒结合较弱的复合结构。glutaredoxin对HAP复合物DNA结合活性的促进及HAP3亚基中半胱氨酸残基突变成丝氨酸残基实验的结果与上述推测较相符。即第68和72位Cys突变为Ser的HAP3蛋白和HAP2蛋白相互作用即具有CCAAT盒结合活性。
到目前为止，已经报告过许多转录因子，如c-fos和c-jun(Abate等1990)，NFκB/Rel(Matthews等 1992)，c-Myb(Guehmann等1992)，BPV-1(McBride等1992)，USF(Pognonec等1992)和NF-Y(Nakshatri等1996)等的DNA 结合活力均受redox调节。其中NF-Y是从人与小鼠细胞中克隆出的能与CCAAT盒结合的转录因子， 它也是异源多聚体蛋白。NF-YA、NF-YB分别为酿酒酵母的HAP2、HAP3的类似基因，两者中有高度同源的结构域，且功能上可互换(Maity等1992, Kim等1996，Coustry等1995)。另外至今所发表的HAP3类似蛋白中3个半胱氨酸残基的位置是保守的(Xing等1993)。
Nakshatri等(1996)报告小鼠的NF-Y转录因子与CCAAT盒在体外的结合活力受redox 状态的调节。硫氧还蛋白可以增强NF-Y异源多聚蛋白与CCAAT盒结合的活力，当－SH基被烷化后NF-Y与CCAAT的结合活性受到破坏。通过将蛋白分子的半胱氨酸残基逐个突变去除，证明受调节的是NF-YB亚基中的第85位与89位上的两个半胱氨酸，已知硫氧还蛋白与谷胱甘肽氧还蛋白一样，也是细胞中一种氧化还原调节系统， 因此我们报告的glutaredoxin在没有HAP5的情况下能使HAP2 与HAP3 结合在CCAAT盒上的发现，与他们的结果特别是硫氧还蛋白对NF-Y蛋白与CCAAT盒结合活性的调节作用可以互为佐证，并对进一步了解HAP5(NF-YC)亚基的功能有重要的意义。

国家自然科学基金(39893320)资助项目。

作者单位：中国科学院上海植物生理研究所，上海 200032

⑷ 蛋白的表达与纯化

蛋白表达纯化已经是非常经典简单的实验了，没有LSS说的那么吓人。
说说我的蛋白表达纯化以及下面的单抗制作工作总体设计概要吧：

1 首先要知道你要纯化蛋白的编码DNA序列，查阅相关文献，看目的基因在那些细胞或者组织中高表达，进而设计该基因的引物，扩增出目的DNA片段的ARF。这一布叫目的基因片段的获取

2 构建表达载体：根据你获得的基因本身的特性确定原核或者真核载体中表达，这一步的主要问题就是构建带有目的基因的质粒，导入表达系统中。一般原核表达时间短，成本低，表达量大，常优先考虑；但是有些基因在E coli中就是表达不出，可能是密码子优化等出现问题，也或者是由于想纯化得到更好的活性蛋白的考虑（原核的蛋白折叠系统显然没有真核的好），有很多研究者选择在毕赤酵母中表达。（我手里就有相关资料，因为以前做过表达纯化及后来的单抗制备），这一步再强调一下，优化密码子对于蛋白的成功表达很重要

3 载体构建好了，下面就是重组蛋白的表达了。这一过程涉及到用多少的诱导剂，诱导多少时间才能得到最多的蛋白的问题，即优化表达条件。就是在上述不同量诱导剂诱导条件下，取菌体上清（分泌型）或者破碎细胞（胞内表达的蛋白）电泳，看是否得到目的分子量大小的蛋白

4 蛋白表达成功，下面是根据蛋白质本身亲水/疏水，电荷带电特性等确定蛋白纯化的方法。一般步骤：离心，取蛋白所在的相
如果是分泌表达的蛋白，则取上清，超滤，没有超滤仪器可以用透析袋等代替，用离子交换柱层析。基本上这一步能得到纯化的95％的蛋白，电泳鉴定基本不会看到有杂带出现。如果还是纯度不符合要求，可以在表达蛋白最初在构建表达载体质粒的时候在蛋白的ORF后面加上HIS－标签，这样得到的蛋白不但可以用于HIS柱的进一步纯化，在不确定自己的融合蛋白是否有表达的时候，也可以单单用抗HIS的抗体做一WB，分析确认目的蛋白是否表达，这是蛋白表达的常用手段。

5 经过纯化后的蛋白仍然含有一部分无机盐，如果需要的话可以将蛋白经真空冻干机冻干，得到纯蛋白。

我们实验室做出来的一个蛋白，编码序列GC含量高75达％，但是功夫不负有心人，只要你想做那件事情，积极的寻找解决问题的手段，总会搞定的，没有跨不过的坎。如果坎太宽，搭桥解决总行。

⑸ 内源性活性物质的药用价值

内源性活性物质，所谓内源性，就是指身体内含有，与人的生存和健康息息相关，尤其对皮肤抗衰老有巨大贡献。它们摄入不足，就会削减皮肤的免疫、抗损伤能力，造成皮肤衰老。目前，内源性活性物质已广泛运用于美白、保湿以及抗衰老等功效型化妆品中。以具有抗衰老功效的化妆品为例，此类护肤品中多数都含有维生素C、E，神经酰胺，透明质酸，超氧化物歧化酶SOD等天然内源性物质。随着分子生物学和生物化学的不断发展，越来越多的内源性生物活性物质会展现其药用价值。
以下列举几种具有抗衰老作用的内源性活性物质：
（1）乙酰化六肽（祛皱肽）
抗衰老原理：曾经有生物学家说过，补肽就等于补生命，可见肽对于抗衰老的重要性。祛皱肽，学名又叫乙酰化六肽，类肉毒素成分，它有肉毒素的功能，但没有肉毒素的毒性。阻断肌肉神经传递速度，从而抑制表情纹及细小皱纹的产生多肽通常由10-100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物。多肽是人体重要的生理调节物，它可全面调节人体生理功能，有效抗击衰老。
（2）维生素C
抗衰老原理：提起维生素C，相信没有人会陌生。它是水溶性物质，能够重建真皮表皮结合部，促进胶原纤维生成。此外还具有很强的清除自由基能力，同时也是增强身体免疫力不可缺少的成分。研究证明，经常补充维生素C的人比普通人的寿命更长，它富含于瓜果蔬菜当中，胡萝卜、西红柿和柑橘类水果中都含有丰富的维C。
（3）二胜肽 抗衰老原理：胜肽最近一直是化妆品科研领域最热门的话题，因为胜肽成分先进，效果显著，被很多药妆品牌使用。但是胜肽的价格很贵，所以添加了胜肽的产品也卖的比较贵。一般来说，胜肽能促进胶原蛋白，弹力纤维和透明质酸增生，提高肌肤的含水量，增加皮肤厚度以及减少细纹。继之前的五胜肽与六胜肽大热之后，最近二胜肽也被广泛的应用在了抗衰老的护肤品中。
（4）透明质酸
抗衰老原理：它是透明的人体天然保湿成分，可以持久保湿，促进其他活性成分的吸收，为真皮胶原蛋白和弹性纤维的合成提供良好的环境，减轻老化皱纹痕迹。
(5）维生素E
抗衰老原理：它是被研究和应用最多的抗老成分之一，属于人体主要的脂溶性抗氧化物，可以清除体内自由基以阻断氧化反应的生成，并减轻和修复细胞膜损伤，达到抵抗衰老的作用。由于细胞中只含有极少量的维生素E，且人体自身无法合成，所以只能从外来补充物中获得，未精制的植物油、杏仁、坚果油等都含有较多的维生素E。
（6）SOD
SOD是Super Oxide Dimutese缩写，中文名称超氧化物歧化酶，是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！
（7）蛋氨酸亚砜还原酶A（MsrA）蛋氨酸亚砜还原酶A是继超氧化物歧化酶之后的另一种引起自由基医学界和老年医学界广泛关注的抗氧化酶。与超氧化物歧化酶相比，它不仅可以在细胞内发挥清除氧化因素的作用，还可以对已经发生蛋白质氧化进行有效修复，增加它的水平和活性可以延长多种生物的寿命。蛋氨酸亚砜还原酶A的表达在多种衰老组织中显著下降。
蛋氨酸亚砜还原酶A（MsrA）是目前发现的可在生物体内还原逆转蛋白质蛋氨酸残基氧化结构变化和功能损伤的主要抗氧化酶系统。硫氧还原蛋白（Trx）是一种低分子量、进化上高度保守的有还原二硫键氧化产物活性的蛋白质，主要功能是调节细胞胞内氧化还原平衡，参与氧应激诱导的细胞凋亡。它既是MsrA系统在体内发挥功能最重要的伴侣分子，同时也是还原体内半胱氨酸残基氧化最重要的功能分子。
最新研究表明，华中科技大学曾建华博士等人利用基因工程技术开发的 ，可以进入细胞显著减少氧化应激引起的细胞损伤，清除氧自由基并降低氧化应激引起的蛋白质氧化水平，减少衰老过程中脂质过氧化引起的细胞损伤，缓解衰老过程中脂质过氧化引起的病理变化。
总之，我国未来药物、药妆品发展应抓住机遇，面向未来，充分利用人类基因组及蛋白质组计划提供的信息，注意开发能控制人类疾病的内源性活性物质作为治疗药物。21世纪，人类的基因组和蛋白质组资料一定会成为新药开发和发展的重要基础。许多生物技术公司和制药公司已开始意识到未来在使用这些信息方面有着巨大的潜力，我国亦应充分给予重视，并给予较大投入。

⑹ 简述检测还原糖、蛋白质所用试剂的名称、配方，使用方法和实验现象

还原性糖 ： 斐林试剂； 是由氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的溶液和硫酸铜的质量分数为0.05 g/mL的溶液配制而成的； 斐林试剂使用时，先将两者等体积溶液混和， 而后立即使用在加热的条件下，能够生成砖红色的氧化铜沉淀。 蛋白质： 双缩脲试剂； 是是由氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的溶液和硫酸铜的质量分数为0.01 g/mL的溶液配制而成的； 双缩脲试剂使用时，先加适量氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的溶液，充分振荡，然后加3-4滴硫酸铜的质量分数为0.01 g/mL的溶液； 振荡摇匀，溶液颜色为为紫色。

⑺ 氧化应激的生物标志物

评价方法
氧化应激的定量评价方法大致分做三类：1）测定由活性氧修饰的化合物；2）测定活性氧消除系统酶和抗氧化物质的量；3）测定含有转录因子的氧化应激指示物。进一步尚有：1）生物体内氧化应激的程度足以产生应答；2）活体内难以蓄积；3）在活体内不是被代谢，而是稳定存在，等等。理解这些要点对于临床普及推广都很有用。
但在临床上，氧化应激的定量仍旧存在问题。因氧化应激与各种各样疾病均密切相关，故缺乏特异性，其量化指标难以用于特别指定的疾病。所以目前认为，当用于“全身评价”，或者在已经明确疾病原因为氧化应激后的“严重程度及予后”的评价。具有代表性的生物标志物：
8-羟化脱氧鸟苷（8-OHdG)
8-OHdG是敏感的DNA损害标志物，因一个氢氧基接在鸟嘌呤的第8个碳上而形成。不过，其氧化“系由氧化应激所产生的羟自由基诱导”这一点，则为1984年葛西首次报道。8-OHdG由高效液相色谱分离后，容易为电化学方法检测出，故许多研究室都能进行测定。另外，已于上世纪90年代研制出8-OHdG的特异性单克隆抗体，此后相关论文显著增加；不但用于理解各种疾病，尚以作为预防医学健康指标的价值更加受到重视。进一步，近年已使用诸多抗氧化物质进行临床干预实验，期待着通过减少8-OHdG，来达到抗衰老和预防疾病目的。
目前报道，可导致8-OHdG上升的疾病就有：慢性病毒性肝炎，系统性红斑狼疮，大肠癌以及幽门螺杆菌感染引起的胃炎等。进一步尚了解到，生活方式亦可使8-OHdG增加，比如吸烟饮酒、剧烈运动、进食过饱和紫外线/放射线的暴露等：人们正在探寻，应该采用怎样的生活方式来控制8-OHdG的水平，形成生活指南，维系个体的健康。
硫氧还原蛋白（TRX）
TRX为细胞内重要的氧化还原调节分子之一；遇有病毒感染、紫外线和环境污染物等各种刺激时，将诱导其细胞内表达。即使TRX单独存在也可表现出对单态氧和羟自由基的消除作用，除可作为抗氧化剂使用之外，还用做还原蛋白的二硫键。进一步，就突触传递， TRX能够抑制ASK1和p38MAPK的活化。再者，认识到TRX也同样向细胞外释放，显示其细胞因子/趋化因子样作用。有报告指出，在与人类疾病的相互关系方面，HⅣ感染者和丙型肝炎患者的血清中，可出现TRX浓度的上升。此外尚注意到，对包括风湿性关节炎在内的自身免疫性疾病、缺血再灌注损伤以及慢性心功能不全之类可导致氧化应激的疾病，亦均可应用TRX做有效评价。TRX已有检测试剂盒。
氧化应激导致的疾病
⒈糖尿病
看法一：胰岛素抵抗源于氧化应激 高游离脂肪酸（FFA）刺激的后果是高活性反应分子 性氧簇（ROS）和活性氮簇（RNS）生成增多，从而启动了氧化应激机制（高活性反应分子产生和抗氧化作用之间长期失衡而引起组织损伤）。这些活性分子可直接氧化和损伤DNA、蛋白质、脂类，还可作为功能性分子信号，激活细胞内多种应激敏感信号通路，这些信号通路与胰岛素抵抗和β细胞功能受损密切相关。
看法二：氧化应激损伤胰岛β细胞
β细胞也是氧化应激的重要靶点 β 细胞内抗氧化酶水平较低，故对ROS较为敏感。ROS可直接损伤胰岛β细胞，促进β细胞凋亡，还可通过影响胰岛素信号转导通路间接抑制β细胞功能。β细胞受损，胰岛素分泌水平降低、分泌高峰延迟，血糖波动加剧，因而难以控制餐后血糖的迅速上升，对细胞造成更为显著的损害。
2004年Ceriello教授提出共同土壤学说，即氧化应激是IR、糖尿病和心血管疾病的共同发病基础，04年是学说，09年已经成为了不争的事实。
看法三：氧化应激加速动脉粥样硬化 低密度脂蛋白（LDL）在动脉内膜的沉积是动脉粥样硬化（AS）始动因素在血管细胞分泌的ROS作用下，“原始”LDL成为氧化型LDL(ox-LDL），刺激内皮细胞分泌多种炎性因子,诱导单核细胞黏附、迁移进入动脉内膜，转化成巨噬细胞。ox-LDL还能诱导巨噬细胞表达清道夫受体，促进其摄取脂蛋白形成泡沫细胞。同时，ox-LDL是NADPH氧化酶激活物，能增强其活性、促进ROS产生，也更有利于LDL氧化为ox-LDL。另外，ox-LDL能抑制NO产生及其生物学活性，使血管舒张功能异常

⑻ 大鼠淋巴细胞流试抗体试剂盒哪里买有链接吗给一个

YYu-ELISA-55414大鼠硫氧化还原蛋白(Trx)ELISA试剂盒，Englishname：TrxELISAKit

YYu-ELISA-55415大鼠硫氧还蛋白还原酶(TrxR)ELISA试剂盒，Englishname：TrxRELISAKit

YYu-ELISA-55416大鼠硫酸褪黑色素(MS)ELISA试剂盒，Englishname：MSELISAKit

YYu-ELISA-55417大鼠硫酸角质素(KS)ELISA试剂盒，Englishname：KSELISAKit

YYu-ELISA-55418兔胱抑素F(CST7)ELISA试剂盒，Englishname：Cystatin-F,CST7ELISAkit

YYu-ELISA-55419兔胱抑素B(CSTB/CST6/STFB)ELISA试剂盒，Englishname：Cystatin-B,CSTB/CST6/STFBELISAkit

YYu-ELISA-55420兔胱抑素A(CSTA/STF1/STFA)ELISA试剂盒，Englishname：Cystatin-A,CSTA/STF1/STFAELISAkit

YYu-ELISA-55421兔胱天蛋白酶8(Casp-8)ELISA试剂盒，Englishname：Caspase8,Casp-8ELISAKit

YYu-ELISA-55422兔胱天蛋白酶-5(CASP5)ELISA试剂盒，Englishname：CASP5ELISAKit

YYu-ELISA-55423兔胱天蛋白酶10(CASP10)ELISA试剂盒，Englishname：CASP10ELISAKit

YYu-ELISA-55424兔胱天蛋白酶1(Casp-1)ELISA试剂盒，Englishname：Caspase1,Casp-1ELISAKit

YYu-ELISA-55425兔胱硫醚β-合酶(CBS)ELISA试剂盒，Englishname：cystathionineβ-synthase,CBSELISAKit等